LES VECTEURS DE CLONAGE AMARA S Les vecteurs
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LES VECTEURS DE CLONAGE AMARA S Les vecteurs de clonage
A. DÉFINITIONS ØUN VECTEUR EST UNE SÉQUENCE D'ADN PERMETTANT LA PROPAGATION, LA SÉLECTION, LA MODIFICATION D'UNE SÉQUENCE D'ADN D'INTÉRÊT. EN BREF L'ÉTUDE ET LA MANIPULATION D'UNE SÉQUENCE D'ADN ISOLÉE. ØLE CLONAGE EST L'ACTION D'ISOLER ET D'INSÉRER DANS UN VECTEUR UN FRAGMENT D'ADN D'INTÉRÊT POUR LE MULTIPLIER À L'IDENTIQUE. ØL'ADN GÉNOMIQUE EST LE SUPPORT PHYSIQUE DE L'ENSEMBLE DES GÈNES DE AMARA S Les vecteurs de clonage
B. UTILITÉ ● PERMET DE CONSERVER SÉQUENCE D'ADN DONNÉE. UNE ● PERMET DE LA MULTIPLIER POUR EN ACCROÎTRE LA QUANTITÉ. ● PERMET DE LA MODIFIER POUR Y INTRODUIRE DES MUTATIONS, DÉLÉTIONS. AMARA S Les vecteurs de clonage
C. PRINCIPES ● UN VECTEUR CIRCULAIRE LINÉAIRE ● UNE CELLULE HÔTE PROCARYOTE EUCARYOTE ●UN FRAGMENT D'ADN GÉNOMIQUE AMARA S Les vecteurs de clonage ADN
I - PROPRIÉTÉS DES VECTEURS DE CLONAGE • CAPABLES DE RÉPLICATION AUTONOME DANS UNE CELLULE HÔTE DONNÉE (ORIGINE DE RÉPLICATION EUCARYOTIQUE) DE TYPE PROCARYOTIQUE ET/OU • POSSÈDENT UN POLYLINKER OU SITE MULTIPLE DE CLONAGE AMARA S Les vecteurs de clonage • POSSÈDENT DES PROPRIÉTÉS PERMETTANT LA SÉLECTION DE LA CELLULE HÔTE (RÉSISTANCE ATB)
NCIPES GÉNÉRAUX D’UTILISATION D’UN VEC - PRÉPARATION DU VECTEUR - PRÉPARATION DE L’ADN À INSÉRER - RÉALISATION D’UN RECOMBINANT - INCORPORATION À L’HÔTE AMARA S Les vecteurs de clonage
1. OBTENTION DE L’ADN RECOMBINANT + TRAITEMENT PAL AMARA S Les vecteurs de clonage
2. LA LIGATION (LIGATURE. . . ) UNE ENZYME, LA LIGASE, EST CAPABLE DE LIER DE FAÇON COVALENTE DEUX MOLÉCULES D’ADN EN UNE. AMARA S Les vecteurs de clonage
3. DIFFÉRENTS VECTEURS POUR TAILLE MAXIMUM APPROXIMATIVE DIFFÉRENTES UTILISATIONS DU FRAGMENT D’ADN QUI PEUT ÊTRE CLONÉ DANS CHAQUE VECTEURSVECTEURHOTE INSERT (Kb) Plasmides Bactérie 10 Phage lambda Bactérie 25 Cosmide Bactérie 45 Phage P 1 Bactérie 100 BAC (bacterial artificial chromosome) Bactérie 300 YAC artificial chromosome) AMARA S (yeast Les vecteurs de clonage Levure 1000
4. LES PLASMIDES COMME VECTEURS DE CLONAGE ØMOLÉCULE D’ADN DE TAILLE RÉDUITE, D'ORIGINE BACTÉRIENNE ØMOLÉCULE D’ADN CIRCULAIRE – TAILLE 2 KB À 5 KB ØPEUT ACCEPTER JUSQU’À 10 KB D’ADN EXOGÈNE ØPEUT ÊTRE CONSIDÉRÉE COMME UN MINICHROMOSOME CAPABLE DE RÉPLICATION AUTONOME ØCONFÈRE LA RÉSISTANCE À UN OU PLUSIEURS ANTIBIOTIQUES= SÉLECTION AMARA S Les vecteurs de clonage
5. LES CLASSES DE PLASMIDES 5. 1. Les plasmides de première génération : Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie génétique. Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au laboratoire. Il s’agit des plasmides suivants : • Col. E 1 • RSF 2124 • p. SC 101 5. 2. Les plasmides de deuxième génération : Ce ne sont pas des plasmides naturels mais résultent de plusieurs transformations : plasmides "artificiels". La série la plus importante de ces plasmides est la série p. BR 312 à p. BR 322. Le plasmide p. BR 322 est constitué de 4, 4 Kb et possède deux gènes de résistance : un pour la tétracycline (Tc. R), l’autre pour l’amplicilline (Ap. R). il possède, en plus, 20 sites uniques pour les endonucléases de restriction dont 11 localisés sur les deux gènes de AMARA S Les vecteurs de clonage résistance.
CARTE DU PLASMIDE PBR 322 AMARA S Les vecteurs de clonage
p. UC 18 POLYLINKERS DE PUC 18 ET ACGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCACTG PUC 19 Polylinker p. UC 19 ACGCCAAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCACTG Polylinker 5. 3. LES PLASMIDES DE TROISIÈME GÉNÉRATION : LA FAMILLE PUC : ONT UNE TAILLE QUI AVOISINE 2, 6 KB ET AYANT INTÉGRÉ LES GÈNES DE RÉSISTANCE À L’AMPICILLINE (APR) ET LACZ. UN POLYLINKER IDENTIQUE À CELUI DU AMARA S Les vecteurs de clonage PHAGE M 13 EST ASSOCIÉ À LACZ. LES DIFFÉRENTS PUC (DE PUC 8 À PUC 19) NE DIFFÉRENT QUE PAR LE NOMBRE DE NUCLÉOTIDES
LES PLASMIDES COMME VECTEUR DE CLONAGE AMARA S Les vecteurs de clonage
6. INTRODUCTION DE L’ADN RECOMBINANT DANS LES TYPE PROCARYOTIQUE CELLULES HÔTES DE (BACTÉRIES): CAS D’UN VECTEUR PLASMIDIQUE: L’ADN EST INTRODUIT DANS LES BACTÉRIES TRAITÉES SPÉCIALEMENT LE PLUS SOUVENT PAR CHOC THERMIQUE OU PAR CHOC ÉLECTRIQUE. AMARA S Les vecteurs de clonage ÉLECTROPORATEUR
6. 1. IDENTIFICATION DES CLONES INTÉRESSAN DANS CE CAS LES BACTÉRIES TRANSFORMÉES AVEC LE VECTEUR NE POSSÉDANT PAS OU POSSÉDANT L’INSERT SONT SÉLECTIONNÉES UN CRIBLAGE EST NÉCESSAIRE AMARA S Les vecteurs de clonage
6. 2. CRIBLAGE DES CLONES INTÉRESSANTS PBR 322 AMPR TETR AMARA S Les vecteurs de clonage AMPR TETS CLONE INTÉRESS
-SCREENING- DES CLONES INTÉRESSANTS TEST BLANC-BLEU COMPLÉMENTATION) AMARA S Les vecteurs de clonage (Α-
LES PHAGES Virus de bactérie-infectieux : Rendement +++ • λ : 48 Kb • Les phages et les bactéries hôtes sont généralement mutées pour éviter le cycle de Lysogénie au profit du cycle lytique. • Grande partie non essentielle VECTEURS 2 Types : • Insertion c. DNA Faible capacité ≤ 10 Kb • Délétion : substitution Partie non essentielle « stuffer » est délétée et remplacée : ≤ 25 Kb • Sélection spi. AMARA S Les vecteurs de clonage
7. LES PHAGES COMME VECTEURS DE CLONAGE PHAGE = VIRUS DE BACTÉRIES AMARA S Les vecteurs de clonage
AMARA S Les vecteurs de clonage
7. 1. INTRODUCTION DE L’ADN RECOMBINANT DANS LES CELLULES HÔTES DE TYPE PROCARYOTI QUE: AMARA S Les vecteurs de clonage CAS D’UN VECTEUR PHAGIQUE
8. LES COSMIDES COMME VECTEURS DE CLONAGE AMARA S Les vecteurs de clonage
9. LES YACS COMME VECTEURS DE CLONAGE AMARA S Les vecteurs de clonage YAC : YEAST ARTIFICIAL CHROMOSO ME
10. BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES BAC : ● AVANTAGES – GRANDE CAPACITÉ D'INSERTION – FACILITÉ DE MANIPULATION (COMME 7. 4 KB PLASMIDE) – HÔTE BACTÉRIEN – COPIE UNIQUE ● PARA, PARB AND REPE – PAS (PEU) DE SONT DES GENES REQUIS RÉARRANGEMENT POUR LA STABILITÉ DU BAC. ● ORIS EST UNE ORIGINE DE RÉPLICATION AMARA S Les vecteurs de clonage ● CM : GÈNE DE RÉSISTANCE AU CHLORAMPHENICOL
III - APPLICATIONS DES VECTEURS - CLONAGE ET AMPLIFICATION D’UNE SÉQUENCE D’ADN CRÉATION DES BANQUES GÉNOMIQUES ET D’ADNC D’ADN - INTRODUCTION D’UN GÈNE DANS DES CELLULES, DES PLANTES OU DES ORGANISMES (ANIMAUX TRANSGÉNIQUES) - PRODUCTION D’ARN - PRODUCTION DE PROTÉINES CODÉES PAR LES GÈNES INSÉRÉS AMARA S Les vecteurs de clonage
BANQUES D’ADN -BANQUES GÉNOMIQUE - BANQUES DE CDNA AMARA S Les vecteurs de clonage D’ADN
PRINCIPE DU CLONAGE (CAS D’UNE BANQUE GÉNOMIQUE) AMARA S Les vecteurs de clonage
BANQUE (LIBRAIRIE) D’ADN GÉNOMIQUE AMARA S Les vecteurs de clonage
BANQUE D’ADNC LE PROBLÈME ICI EST L’OBTENTIO N DE CLONE DIT « FULL LENGTH » . AMARA S Les vecteurs de clonage
OBTENTION DE L’ADN DE L’ORGANISME DONNEUR A PARTIR L’ARN: DE PRINCIPE DE "REVERSE LA TRANSCRIPTION": AMARA S Les vecteurs de clonage
PRODUCTION DE PROTÉINES HUMAINES À BUT THÉRAPEUTIQUE - FACTEUR VIII DE LA COAGULATION DANS L’HÉMOPHILIE A - HORMONE DE CROISSANCE - INSULINE AMARA S Les vecteurs de clonage
RANSFERT ET CLONAGE DU GÈNE DE L’INSULI AMARA S Les vecteurs de clonage
CELLULES HÔTES -BACTÉRIES : E. COLI PREMIER HÔTE UTILISÉ NOMBREUX VECTEURS PLASMIDIQUES CONNUS ET UTILISABLES CULTURE EN MASSE DANS LES FERMENTEURS TAUX D’EXPRESSION ÉLEVÉS (PLUSIEURS G DE PROTÉINE/LITRE) MAIS SECRÈTENT MAL LES PROTÉINES : ÉCLATEMENT DES BACTÉRIES -PAS DE MODIFICATIONS POSTTRADUCTIONNELLES -LEVURE SACCHAROMYCES CEREVISIAE MODIFICATIONS POST TRADUCTIONNELLES Les vecteurs de clonage MAIS PAS DE SECRÉTION, MOINS BON RENDEMENT AMARA S
AUTRES EXEMPLES LEVURES ET BACTÉRIES UTILISÉES COMME USINES: PRODUCTION D'ANTIBIOTIQUES PÉNICILLINE, TÉTRACYCLINE-, D'ENZYMES COMME LIPASES LESSIVES-. . . VACCINS : FRACTION DE PROTÉINES VIRALES NÉCESSAIRE À LA PRODUCTION D’AC AMARA S Les vecteurs de clonage
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