Les techniques histologiques Oules principes fondateurs Les principes

Les techniques histologiques Ou…les principes fondateurs

Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !…

Mais qu’est ce qu’un microscope ? … • Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet. • Une lentille est un focalisateur de rayonnement Photonique : lentille en verre Convexe Concave De particules subatomiques : lentille électromagnétique

Pour Mais qu’est ce qu’un microscope ? … • Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet. • Une lentille est un focalisateur de rayonnement • Un microscope fournit une image, perçue par l’œil. Il faut donc obtenir en sortie du microscope des rayons lumineux. • l’objet modifie le rayonnement. Il peut modifier son amplitude (intensité), sa longueur d’onde (couleur), ou sa phase.

Le premier « microscope… » Janssen, 1595

Robert Hooke : l’acte de naissance de la cellule Micrographia (1665) « De la structure du liège et des cellules ou des pores de quelques corps spongieux du même genre »

REFLECTION Antonin van Leeuwenhoek 1674 : « animalcules » 1683 : bactéries 1830 à 1860 : la théorie cellulaire Brown (1831) : noyau cellulaire des cellules d’orchidée Schwann (1839) : « Recherches microscopiques sur la concordance dans la structure et dans la croissance des animaux et des végétaux » TRANSMISSION

Oculaire Objectif (Objet) Condensateur Source de lumière Un Olympus récent… (1998) Le premier Nikon (1900)

Quel est donc le principe du microscope ? … GROSSIR… Loupe Rétine

Quel est donc le principe du microscope ? … GROSSIR… Loupe Rétine

Quel est donc le principe du microscope ? … GROSSIR… Objectif Oculaire Rétine Grossissement = Objectif x Oculaire

Mais comment grossir ? … 10 x 100 = ? …

Mais comment grossir ? … RESOLUTION

Le grossissement peut se faire sans résolution. . . Photo de journal Photo de livre d’art 100 X …si l’information initiale est insuffisante !

Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Pour un microscope utilisant le rayonnement photonique, un grossissement de plus de 1500 fois donne une image trouble : Quelle que soit la qualité des lentilles, la résolution d’un microscope est limitée.

Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope • Abbe utilise une théorie à la mode : il admet que l’image créée par un microscope est liée à des interférences entre les rayons non modifiés par l’objet, et les rayons diffractés par l’objet. • La Rayon « quantité d’information » est donc d’autant Rayon directs plus réfractés importante que des spectres de diffraction d’ordres supérieurs peuvent participer à la formation de l’image. • Les spectres secondaires sont répartis dans l’espace ; le fait de capter un plus grand nombre de rayons doit donc donner une meilleure image. . .

Et ça marche. . .

Le nombre de spectres secondaires récupérés par un objectif dépend de son : ouverture numérique L’ouverture numérique est le sinus de l ’angle que fait le dernier rayon qui pénètre dans l’objectif avec l’axe de celui-ci, multiplié par l ’indice de réfraction du milieu traversé par les rayons lumineux. a Sinus car fonction croissante n car cela permet de modéliser les performances des objectifs à immersion… et de comprendre le prix de ces objectifs (pensez aux bords…) ou des objectifs à grande distance frontale (pourquoi ? …. ) !

Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Dans ce modèle, la distance minimum entre deux points pour qu’ils soient détectés peut alors être évalué n. sin a = ouverture numérique de l’objectif l = longueur d'onde de la lumière incidente k = coefficient variant entre 0, 5 et 1, 22 (en fonction des capacités de l'œil, en particulier à distinguer les différences de luminosités, et de l’orientation de la source lumineuse. En règle générale, on prend k = 0, 61) Les meilleurs objectifs ont une ouverture numérique de 1, 4 ( a = 70°, huile à immersion d’indice 1, 15 ) : D’où d = 194 nm pour les radiations bleues (450 nm)… C’est la limite de résolution théorique du microscope optique Grosso modo, la résolution est limitée à la moitié de la longueur d’onde du rayonnement

Université de Toronto (1938)

Porter KR, Claude A & Fullam EF (1945) J. Exp. Med. 81 : 233 -246

RCA scope (1956) JEOL (années 1980)

Le petit dernier de Philips. . . UHV-TEM de Jeol

Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… 2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste Problème : transmission…. Il faut passer au travers de l’objet ! D’où l’idée de le couper en tranches fines

- couper implique de durcir… par congélation par inclusion paraffine plastique - inclure implique de maintenir. . . par fixation chimique - observer implique de contraster. . . par coloration générale élective par histochimie par immunocytologie

D’où le déroulement classique : • • Fixation de l’objet Inclusion Coupe Coloration / contraste et enfin… Observation qui sera adapté - en fonction des contraintes des techniques microscopiques - en fonction du but recherché. . .

• • Fixation : le pari impossible Inclusion Coupe Coloration / contraste / observation Stabiliser la structure sans l’altérer… - fixateurs coagulants (précipitants) - fixateurs non coagulants (pontants) - Méthanol, acétone - Acide acétique, acide picrique - Composés mercurés Glutaraldehyde Formaldehyde Tétroxyde d’osmium

• • Fixation : le pari impossible Inclusion Coupe Coloration / contraste / observation Stabiliser la structure sans l’altérer… - fixateurs coagulants (précipitants) - fixateurs non coagulants (pontants) Et leurs mélanges : Formol, liquide de Bouin, de Carnoy, de Zencker, . . . Gray (1954) dresse un liste de 700 mélanges fixateurs … et précise qu’elle est très incomplète ! Fixer est un art aussi difficile que la cuisine. . .

• • Fixation : le pari impossible Inclusion : réussir le melting pot Coupe Coloration / contraste / observation Enrober la structure sans la déformer… Milieu liquide qui peut se solidifier … suffisamment pour être coupé fin ! • Paraffine • Résines plastiques (Araldite, Epon, Métacrylates…) Problème… : ce sont des milieux hydrophobes ! Nécessité de déshydrater après fixation : alcool, acétone, . . . Inclure demande de la patience. . .

• • Fixation : le pari impossible Inclusion : réussir le melting pot Coupe : jouer avec le fil du rasoir Coloration / contraste / observation Trancher la structure suffisamment fin… Optique : Electronique : 5 à 20 µm Microtome couteau acier 50 à 80 nm Ultramicrotome rasoir verre / diamant Couper demande du doigté. . .

Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… 2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste - couper implique d’inclure - inclure implique de fixer - observer implique de contraster. . . 3 - Les principaux types de microscopie

Optique Fond clair Contraste de phase Nomarski (contraste d’interférence différentielle) Fond noir

Optique Microscopie à fond clair : colorations Hémalun - Eosine Des recettes de cuisine !!! Azan

Optique Microscopie à fond clair : colorations électives Des recettes de cuisine !!!

Optique Microscopie à fond clair : histochimie Problème particulier : Comment préserver l’activité enzymatique Des recettes de cuisine !!!

Optique Microscopie à fluorescence Problème particulier : Comment préserver à la fois l’antigénicité et la structure. . . & al. : F-microscopies (FRAP, FLIP, FRET…) microscopies à effet tunnel, . . .

Remarques techniques… Colorants : • Affinité pour les molécules chargées négativement (acides nucléiques…) : - Les colorants sont chargés positivements ( « bases » ) Exemple : Hématoxyline, Hémalun, - Les structures sont dites basophiles Exemple : noyau, ribosomes (donc REG…) • Affinité pour les molécules chargées positivement : - Les colorants sont chargés négativement ( « acide » ) Exemple : éosine - Les structures sont dites acidophiles Exemple : cytoplasme

Remarques techniques… Artéfacts… : • Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation REMARQUE : tout espace non coloré… … n’est pas forcément un artéfact !

Remarques techniques… Artéfacts… : • Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation • Stries / plis : - lié à la coupe / étalement

Remarques techniques… Artéfacts… : • Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation • Stries / plis : - lié à la coupe / étalement • Crapoteries variées et diverses… : - lié à la poussière ambiante, aux colorants, ….

Electronique : transmission Coupes Ultrafines (50 à 80 nm = 10 fois la membrane plasmique…) Contraste : Sels de métaux lourds (Acétate d’uranyl, citrate de plomb)

Electronique : transmission

Apparté : Tomographie. . .

Apparté : Tomographie. . .

Apparté : Tomographie. . .

Apparté : Tomographie. . .

Apparté : Tomographie. . .

Apparté : Tomographie. . .

Apparté : Tomographie. . .

Electronique : transmission

Electronique : balayage ou… le retour de la REFLECTION

Electronique : balayage

Electronique : balayage