LES NOUVEAUX OUTILS DE DIAGNOSTIC DANS LES FIVRES

LES NOUVEAUX OUTILS DE DIAGNOSTIC DANS LES FIÈVRES M. Bouyou Akotet UNIVERSITE DES SCIENCES DE LA SANTE LIBREVILLE - GABON Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

DIMINUTION DE LA MORBIDITE LIEE AU PALUDISME ENTRE 2000 ET 2015 Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

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EMERGING OR REEMERGING PATHOGENS Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

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DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE SPECIFIQUE ≥ 30 TESTS D’Acremont et al, 2014 Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

PROBLEMATIQUE • Multiplicité des examens et des prélèvements • Distinguer les infections parasitaires, notamment le paludisme des pathologies fébriles non palustres (Non Malarial Febriles Illness, NMFI) • Distinguer au sein des NMFI les infections bactériennes invasives et/ou sepsis sévères des infections virales et même fongiques • Spécificité de l’hôte: enfant, adulte, femme enceinte, HIV… • Urgences ++++ • Pathogène en cause dans contexte de co-infections Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire (Bissonnette et Bergeron 2014)

TESTS POINT OF CARE (POC TESTING) • Toute technique de diagnostic réalisable au niveau ou près du patient • Fournit des résultats fiables dans des délais très courts afin de permettre une prise de décision rapide (triage, transfert ou référence et traitement, hospitalisation…) au cours de la même visite • Technologies très diverses: à partir d'immuno-essais simples à des anticorps nucléiques plus sophistiqués, amplification des acides nucléiques • Diverses utilisateurs (apprenants à très entrainés) • Performances diverses (tests « maisons » à tests spécialisés dans les laboratoires de référence «près de soins» ). Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE Principe Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

PRESENTATION DES TDRs Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

REALISATION DES TDRS Puits d’échantillon (a) (b) fenêtre pour les résultats (c) (d) 4 gouttes Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire Puits pour le diluant

TYPES DE TDRs PALUDISME Paramètres Test Pf. HRP 2 Test pf. HRP 2 et aldolase Test LDH Antigène(s) détectés Présentation général Détection Espèces autres que P. falciparum HRP 2 2 lignes HRP 2 et Aldolase 3 lignes HRP 2 et LDH 3 lignes Les 4 espèces Détection mais différentiation impossible Détection comme P. falciparum Co-infection (P. falciparum et autres) Persistance des Ag après traitement Indication sur la viabilité des parasites Jusqu’à 31 jours Plus longue pour l’antigénémie Jusqu’à 1 à 3 semaines Non La réaction positive indique la présence de parasites vivants P. falciparum Détection impossible Détection comme P. falciparum NB: ALDOLASE Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

TDRS AVANTAGES • Ne nécessitent aucune formation particulière • Résultats en 5 -20 minutes • Sensibilité au-delà de 95% • p. LDH parasites vivants • Pas de différence de sensibilité en fonction des formes cliniques • Utilisation dans les zones les plus reculées Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

NMFI Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

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BIOMARQUEURS Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

Automates et TDR en cours de mise au point Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

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BIOLOGIE MOLECULAIRE Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

LAMP » LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION » TECHNIQUE D'AMPLIFICATION ISOTHERME DE L'ADN FACILITÉE PAR BOUCLE − Principe: amplification d’une séquence d’ADN cible avec une haute sensibilité et spécificité, le tout dans des conditions isothermales et en une heure environ. − Méthode alternative à la PCR avec plusieurs déclinaisons (la LAMP classique, la LAMP en temps réel, la RT-LAMP ou encore la RTLAMP en temps réel) − Simple, ne nécessitant pas de matériel sophistiqué, ni de personnel particulièrement qualifié (Parida et al, 2008) − − − Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future Pratique sur le terrain prospects. Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Pathogènes: virus, bactéries (BMR), champignons, parasites Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de J Microbiol. 2015 Jan; 53(1): 1 -5. doi: Côte d'Ivoire 10. 1007/s 12275 -015 -4656 -9. Protocoles « maison » dont certains en cours de validation

LAMP An immunoassay-based reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of avian influenza H 5 N 1 virus viremia. Tang Y, Yu X, Chen H, Diao Y. Biosens Bioelectron. 2016 Dec 15; 86: 255 -61. doi: 10. 1016/j. bios. 2016. 063. [Visual Detection of Human Coronavirus NL 63 by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification]. Geng H, Wang S, Xie X, Xiao Y, Zhang T, Tan W, Su C. Bing Du Xue Bao. 2016 Jan; 32(1): 56 -61. Development and application of a rapid detection system for human papillomavirus and Herpes simplex virus-2 by loop-mediated isothermal amplification assay. Yang JF, Zhao CZ, Lu KX. Microb Pathog. 2016 Aug; 97: 178 -82. Clinical evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid detection of Neisseria meningitidis in cerebrospinal fluid. Lee D, Kim EJ, Kilgore PE, Kim SA, Takahashi H, Ohnishi M, Anh DD, Dong BQ, Kim JS, Tomono J, Miyamoto S, Notomi T, Kim DW, Seki M. Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de PLo. S One. 2015 Apr 8; 10(4): e 0122922. Côte d'Ivoire Real-time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for rapid and reliable diagnosis of pulmonary tuberculosis. Cao D, Hu L, Lin M, Li M, Ye Z, Sun H, Huang J, Yang H, Tian J. J Microbiol Methods. 2015 Feb; 109: 74 -8

LAMP Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of Aspergillus fumigatus. Tang Q, Tian S, Yu N, Zhang X, Jia X, Zhai H, Sun Q, Han L. J Clin Microbiol. 2016 Apr; 54(4): 950 -5. The Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for the Rapid Detection of Salmonella enterica serovar Typhi. Fan F, Du P, Kan B, Yan M. PLo. S One. 2015 Apr 24; 10(4): e 0124507. The enhanced pneumococcal LAMP assay: a clinical tool for the diagnosis of meningitis due to Streptococcus pneumoniae. Kim DW, Kilgore PE, Kim EJ, Kim SA, Anh DD, Dong BQ, Kim JS, Seki M. PLo. S One. 2012; 7(8): e 42954 Application of loop-mediated isothermal amplification technique to rapid and direct detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in blood cultures. Misawa Y, Yoshida A, Saito R, Yoshida H, Okuzumi K, Ito N, Okada M, Moriya K, Koike K. J Infect Chemother. 2007 Jun; 13(3): 134 -40. Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

SYSTEMES AUTOMATISES POUR LA DETECTION MOLECULAIRES DES AGENTS INFECTIEUX Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

PLATEFORMES AUTOMATISEES • Diagnostic moléculaire utilisant la technologie de multiplexage. • Capacité de la PCR en temps réel à amplifier et à détecter le produit à amplifier, en utilisant des sondes spécifiques en même temps, avec Amplifications multiples dans le même échantillon clinique au même moment • Etape la critique dans la PCR multiplex: conception d'amorces de sorte que l'efficacité et l'amplification spécifique ne soient pas compromises • Produits de diagnostic approuvés par la FDA sont déjà disponibles pour les pathogènes respiratoires virales. Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

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Biotechnol Adv. 2016 Dec; 34(8): 1275 -1288. doi: 10. 1016/j. biotechadv. 2016. 09. 003. 26. Advances in nanomaterials and their applications in point of care (POC) devices for the diagnosis of infectious diseases. Tram DT 1, Wang H 2, Sugiarto S 3, Li T 4, Ang WH 5, Lee C 6, Pastorin G 7. • Dispositifs de point de service (POC) pour la détection sélective de biomolécules à l'aide de nanoparticules d'ingénierie devenus une poussée de recherche principale dans le domaine du diagnostic. • Nanotechnologie associée au POC, actuellement appliquée pour l'identification des acides nucléiques, des protéines et des anticorps, utilisés aussi dans la détection des pathogènes infectieux Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

TUBERCULOSE Rapid, comprehensive, and affordable mycobacterial diagnosis with whole-genome sequencing: a prospective study. Pankhurst LJ, Del Ojo Elias C, Votintseva AA, Walker TM, Cole K, Davies J, Fermont JM, Gascoyne-Binzi DM, Kohl TA, Kong C, Lemaitre N, Niemann S, Paul J, Rogers TR, Roycroft E, Smith EG, Supply P, Tang P, Wilcox MH, Wordsworth S, Wyllie D, Xu L, Crook DW; COMPASS-TB Study Group. . Lancet Respir Med. 2016 Jan; 4(1): 49 -58. Use of WGS in Mycobacterium tuberculosis routine diagnosis. Cirillo DM, Cabibbe AM, De Filippo MR, Trovato A, Simonetti T, Rossolini GM, Tortoli E. Int J Mycobacteriol. 2016 Dec; 5 Suppl 1: S 252 S 253. Diagnostic Accuracy of Gene. Xpert MTB/RIF Assay in Comparison to Conventional Drug Susceptibility Testing Method for the Diagnosis of Multidrug-Resistant Tuberculosis. Pandey P, Pant ND, Rijal KR, Shrestha B, Kattel S, Banjara MR, Maharjan B, Kc R. PLo. S One. 2017 Jan 12; 12(1): e 0169798. Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE -TEMPS D’ENVOL: MALDI-TOF • Technique analytique permettant d’identifier les molécules et de caractériser leur structure chimique, par l’analyse de la masse et de la charge de leurs ions. • MALDI-TOF déterminer la composition élémentaire d’un échantillon. • Identification du genre et de l'espèce d’un microorganisme en quelques minutes Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

MALDI-TOF: PRINCIPE Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

MALDI-TOF: APPLICATIONS Evidence of genotypic diversity among Candida auris isolates by multilocus sequence typing, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and amplified fragment length polymorphism. Prakash A, Sharma C, Singh A, Kumar Singh P, Kumar A, Hagen F, Govender NP, Colombo AL, Meis JF, Chowdhary A. Clin Microbiol Infect. 2016 Mar; 22(3): 277. e 1 Using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry to detect carbapenem resistance within 1 to 2. 5 hours. Burckhardt I, Zimmermann S. J Clin Microbiol. 2011 Sep; 49(9): 3321 -4 Matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clerc O, Prod'hom G, Senn L, Jaton K, Zanetti G, Calandra T, Greub G. Clin Microbiol Infect. 2014 Apr; 20(4): 355 -60. Sensitive and rapid detection of ganciclovir resistance by PCR based MALDI-TOF analysis. Zürcher S, Mooser C, Lüthi AU, Mühlemann K, Barbani MT, Mohacsi P, Garzoni C, Gorgievski-Hrisoho M, Schaller A, Flatz L. J Clin Virol. 2012 Aug; 54(4): 359 -63. Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

CULTURES BACTEC • Les microorganismes, s'ils sont présents dans l • es échantillons de sang, métabolisent les nutriments • et libérer du CO 2 dans le milieu ou utilisent l'oxygène, • la fluorescence du capteur de flacon augmente à mesure • que le CO 2 est produit ou l'oxygène est utilisé. • Analyse de la quantité de CO 2 produits ou d'O 2 utilisés • Antibiogramme • Antifongigramme en cours VITEK MS • système de spectrométrie de masse MALDI-TOF 1. • Détection de 297 espèces de pathogènes dont le groupe de mycobactéries responsables de la tuberculose (TB), 45 espèces de mycobactéries non tuberculeuses (MNT) les plus communes et 48 Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de espèces de moisissures d’importance médicale, Côte d'Ivoire

CONCLUSION • L'évolution de la résistance aux pathogènes infectieux , la transition épidémiologique dans le paludisme qui n’est plus la première cause de décès chez les patients fébriles, nécessité de mise au point de nouvelles méthodes de détection utilisés directement sur des échantillons dans les laboratoire de microbiologie clinique devant constituer des plateformes de références comprenant • Des tests de diagnostic rapides pathogènes • Des tests de sensibilité aux anti-infectieux • Des tests d'hybridation in situ en fluorescence, • Des systèmes automatiques de réaction en chaîne par polymérase, des microarrays, • la spectrométrie de masse, • Le séquençage. APPROCHE PRODROMIQUE AVEC PLATEFORME DE LABORATOIRES DE POINTE ET ALGORITHME DECISIONNELS STANDARDISES « CHALLENGE » mais « =AVENIR » Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire

MERCI Journées scientifiques du programme PCC-CI/ Site ANRS de Côte d'Ivoire