LEISHMANIOSES Porque estudar leishmaniose Grande endemia 88 pases

LEISHMANIOSES

Porque estudar leishmaniose? Grande endemia: 88 países 350 milhões de pessoas ameaçadas 12 milhões infectadas (2 mi/ano) Alta incidência no Brasil Deprime sistema imunológico- associação com HIV Está chegando em São Paulo!

üEnfoque desta aula: ØAgente etiológico ØEpidemiologia ØTransmissão – Vetor ØCiclo de vida ØPatogenia ØDiagnóstico ØTratamento ØControle

Tripanossomatídeos parasitas Ordem Kinetoplastida Família Trypanosomatidae Gêneros Leishmania - leishmaniose tegumentar e visceral Trypanosoma - T. cruzi - Doença de Chagas T. brucei- Doença do Sono Phytomonas - parasitas de plantas

Leishmania Família Trypanosomatidae Gênero Leishmania Sub-gêneros Leishmania Viannia 20 espécies patogênicas homem

FORMAS DO PARASITA Amastigota Intracelular (anaeróbio) (2 -6 um) Promastigota Vetor, cultura (aeróbico) (14 -20 um)

Promastigota Reprodução por fissão binária no inseto vetor Forma invasiva: promastigota metacíclico

Amastigota Céls do sistema mononuclear fagocítico Macrófagos, neutrófilos, células dendríticas Reprodução por fissão binária Milder R, 2001

1756 -descrição clínica de leishmaniose 1898 -Borovsky: parasita em paciente com forma cutânea 1903 -Leishman/ Donovan parasita em pacientes com leishmaniose visceral. Leishmania donovani (Ross, 1903) 1904 -Roger cultiva promastigotas 1909 -Lindenberg/Carini&Paranhos: Leishmania no Brasil 1912 -Gaspar Vianna descobre droga (tártaro emético) 1920/1922 -Cerqueira/ Aragão: vetores flebotomíneos

DIVERSIDADE DO GÊNERO LEISHMANIA Evolução clonal Espécies morfológicamente semelhantes (exceções) Transmitidos por diferentes vetores Infectam diferentes hospedeiros vertebrados Diferem quanto as moléculas de adesão, fatores virulência e formas clínicas

FILOGENIA BASEADA NO GENE DE r. DNA invertebrados e plantas Ancestral de tripanosomatideos: parasita de insetos

ABORDAGENS PARA IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES Análise de isoenzimas (lab referência da WHO) Anticorpos monoclonais RFLP (diferença nas seq de DNA) Análise de DNA de cinetoplasto PCR com iniciadores específicos Sondas de DNA específicas

Conceitos taxonômicos confusos. . . 1972 -Lainson & Shaw: 3 complexos de espécies Critérios clínicos, epidemiológicos e biológicos 1987 -Lainson & Shaw: Subgêneros Viannia e Leishmania Critério: regiões do intestino do inseto nas quais ocorre o desenvolvimento das formas promastigotas

Espécies e Formas clínicas Leishmaniose cutânea– L. V. braziliensis, L. L. amazonensis, L. V. guyanensis L. L. major Leishmaniose difusa – L. L. amazonensis Leishmaniose mucocutânea –L. V. braziliensis Leishmaniose visceral –L. L. chagasi, L. L. donovani Novo Mundo Velho Mundo http: //lineu. icb. usp. br/~farmacia/indexdiu. html

Distribuição Geográfica da Leishmaniose Cutânea 1, 5 milhão de casos novos por ano

90% cutâneas: Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita, Síria 90% mucocutâneas: Bolívia, Brasil, Peru 1300 -2500 soldados americanos com LC após Afeganistão e Iraque (AMSA)

Leishmaniose Tegumentar no Brasil Doença de ampla distribuição no território nacional (N, NE, CO, SE) Agentes: Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Causam doença Cutânea, Muco-cutânea e forma cutânea difusa Fonte: Boletim Eletrônico Epidemiológico, LTA, ano 02, n. 05, 2002, Min Saúde

Leishmaniose Tegumentar no Brasil

28. 000 casos/ano

Leishmaniose cutânea – Estado de SP – dados SUCEM

Distribuição Geográfica da Leishmaniose Visceral 500. 000 casos novos por ano

90% viscerais: Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal, Sudão Índia: 50% dos casos do mundo; Bihar (rural): 90% dos casos indianos

Leishmaniose Visceral no Brasil • Distribuição ampla: N, NE, SE, CO • Região NE: 90% década 90 para 77% anos 2000 • Urbanização da LV (surtos RJ, BH, Araçatuba, Natal, São Luís, Santarém, etc. . ) Fonte: Manual de Vigilância e Controle da LV, Min Saúde

DISTRIBUIÇÃO DOS CASOS HUMANOS DE LVA POR MUNICÍPIO DO ESTADO DE SÃO PAULO – 1999 A 2002

DISTRIBUIÇÃO DOS CASOS HUMANOS DE LVA POR MUNICÍPIO DO ESTADO DE SÃO PAULO – 2004 e 2006

3100/ano no Brasil 20 dos 26 estados brasileiros 90% morte em 2 anos Mais agressiva: matava 3/100, agora 7/100 Revista FAPESP, set 2008 Atingiu cidades 8/10 brasileiros em cidades 30% matas consumidas Avanço em direção a SP: Gasoduto Brasil-Bolivia, migrações 30 km/ano 1999 -Araçatuba Em 9 anos 1258 casos (112 mortes)

7 de abril de 1999 Araçatuba registra 1º caso de leishmaniose ARAÇATUBA - A Secretaria Estadual da Saúde registrou o primeiro caso de leishmaniose em um ser humano na cidade de Araçatuba, a 540 quilômetros da capital. CASOS, ÓBITOS e LETALIDADE DE LVA NO ESTADO DE SP ANO Nº CASOS Nº ÓBITOS LETALIDADE 1999 17 5 29, 4 2000 15 - - 2001 57 3 5, 3 2002 114 13 11, 4 2003 146 21 14, 4 Fonte : Di visão de Zoonoses - CVE

Leishmaniose na Europa

Distribuição geográfica leishmaniose visceral/AIDS co-infecção leishmaniose

WHO/UNAIDS: same guidelines for diagnosis and a computerized case report form, both endorsed by WHO

Europa – 1990 - 1998 Número de casos de AIDS Número de casos de co-infecção AIDS/leishmaniose http: //www. who. int/emc-documents/surveillance/docs/whocdscsrisr 2001. html

Associação entre leishmaniose visceral e AIDS Leishmaniose visceral acelera AIDS HIV ativa leishmaniose em portadores antes assintomáticos 1, 5 -9 % indivíduos com AIDS tem leishmaniose visceral Sul da Europa: até 70% indivíduos com leishmaniose visceral tem HIV (drogas) (WHO, 2009)

VETORES Insetos flebotomíneos (Ordem Phlebotominae) 30 spp vetoras (de 500) Lutzomyia e Psychodopigus nas Américas Phlebotomus na África, Europa e Ásia Phlebotomus “Mosquito palha”, birigui

VETORES 2 -3 mm, corpo e asas peludas Marrons mas “luminosos” (oleosidade) Asas em V Regiões temperadas e tropicais (20 a 30 graus) A fêmea se alimenta de sangue no entardecer/noite, com vôo curto (até 100 m), baixo e direto (sem rodeios) Picada dolorida- “bebem” sangue da ferida Ovo- adulto: 4 a 7 semanas Adulto vive 15 a 30 dias

Insetos flebotomíneos Larvas e pupas: habitat úmido, quente e com nutrientes Difícil encontrar locais de desova, larvas e pupas: dificil controle!

VETORES Habitat silvestres/peri-domiciares: lixos e escombros, rachaduras externas de habitações, solo úmido em matas ou florestas, cascas de árvores, tocas de roedores silvestres

VETORES DE LTA NO BRASIL Leishmaniose visceral: L. longipalpis

CICLO Univ. South Carolina

TRANSFORMAÇÃO AMASTIGOTA-PROMASTIGOTA Alterações do microambiente: do fagolissomo ao intestino do inseto Cresce 5 vezes Desenvolve flagelo (1 a 2 vezes seu tamanho) Passa a expressar gp 63 Passa a expressar LPG (algumas espécies já expressavam)

INTERAÇÕES INSETO E PARASITA http: //lineu. icb. usp. br/~farmacia/indexdiu. html

INTERAÇÕES INSETO E PARASITA Macrófagos infectados são ingeridos pelo inseto Amastigotas são liberados e convertem-se em promastigotas (hs) Promastigotas multiplicam-se no intestino do inseto Diferenciam-se em promastigotas metacíclicos (não se dividem) em 1 semana- metaciclogênese Migram para faringe Desenvolvimento no vetor: 10 dias (4 a 25) Compatibilidade parasita-vetor : competência vetorial

SOBREVIVÊNCIA NO VETOR Metaciclogênse: vários estágios Sistema digestivo inseto: enzimas e membrana peritrófica Estágios vulneráveis não são expostos a proteases do inseto Parasita tem quitinase (na hora certa) para romper membrana peritrófica do intestino médio do inseto LPG (lipofosfoglican), majoritário na superfície de promastigotas: -Adesão do parasita ao intestino -Muda na metaciclogênese (1 semana) (Diferenças entre espécies)

SOBREVIVÊNCIA NO VETOR Conclusão da metaciclogênese: saliva e remoção do sangue Migração para região anterior: açúcar e outros Inóculo: regurgitação do aglomerado de metacíclicos Saliva: a. induz vasodilatação, b. previne a coagulação, c. tem propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias (inibe ativação de macrófagos)

Propriedades da saliva do vetor Andrade et al. , 2007

ADESÃO DE PROMASTIGOTA AO MACROFÁGO Fagocitose “facilitada” Ligantes envolvidos: Gp 63, LPG, PPG, proteínas de apoptose Receptores envolvidos: CR, Fn. R, MR, CRP, receptor de cels apoptóticas Ferreira et al, 2003 População depletada de parasitas apoptóticos não sobrevive em macrófagos (PNAS 2006)

Mecanismos de evasão LPG e inibição do burst oxidativo

SOBREVIVÊNCIA NO MACRÓFAGO Após fagocitose (5 a 60 min), promastigotas no vacúolo parasitóforo Fusão de lisossomos fagolisossoma: nutrientes x R Inata Promastigotas amastigotas 30 min 4 h

SOBREVIVÊNCIA NO MACRÓFAGO Receptor de complemento inibe “burst” oxidativo Gp 63 inativa/remove Cp da superfície -Acidificação: p. H ótimo para amastigotas -Gp 63 (protease) e LPG protegem o parasita de enzimas lisossomais -Diminuição de MHC II na superfície do macrófago -Usa IL-2 como fator de crescimento, reduz inflamação (IFNg, IL 1) -LPG induz TGFb e IL 10 e inibe produção NO -Tem SOD: protege contra radicais superóxido burst acidificação fusão com lisossomos

SOBREVIVÊNCIA NO MACRÓFAGO CDC Leishmaniose visceral: L. donovani, L. infantum ou L. chagasi Resistência a temperatura de 37ºC- visceralização? Imunossupressão por LPG: reduz IFNg e IL 12, aumenta TGFb e IL 10 Homem: amastigotas em macrófagos da pele (poucos), gânglios linfáticos, baço, fígado, medula óssea

LIBERAÇÃO DE AMASTIGOTAS DOS MACRÓFAGOS CDC Os amastigotas liberados podem infectar novas células Diferenças: não tem gp 63, algumas espécies não tem LPG Mecanismos diferentes de adesão? (PPG? )

Mecanismos de escape do Sistema Imune Fagocitose silenciosa via receptor de complemento Gp 63 remove/inativa complemento Redução MHC II no macrófago Uso de IL 2, redução de IL 1 e IFNg Leishmaniose visceral: imunossupressão- aumento IL 10 e TGFb, redução IL 12 e IFNg Apoptose e mimetismo apoptótico Fagocitose por neutrófilos

Apoptose (promastigotas) Deolindo, 2008 Promastigotas apoptóticos “altruístas” induzem produção de TGFb e inativam macrófago-sobrevida dos parasitas

Mimetismo Apoptótico (amastigotas) Deolindo, 2008 Amastigotas expõem PS, inativam macrófago mas não entram em apoptose

Science, ago 2008 Neutrófilos (verdes) migram dos vasos (azuis) para local do inóculo de L. major (vermelha) Migração de neutrófilos para beads (azuis) e L. major (vermelha)

Neutrófilos e Leishmania: Cavalo de Tróia? Rápido recrutamento de neutrófilos após inoculação(30 min). LPG inibe lise em alguns neutrófilos Neutrofilos em apoptose (horas) são fagocitados por macrófagos. Leishmania donovani em neutrófilos Macrófagocita neutrófilos com L. donovani Gueirard et al. , 2008

ESTRATÉGIAS DE SOBREVIDA NO MACRÓFAGO

RESERVATÓRIOS Depende do microambiente do vetor e da espécie de Leishmania Tegumentares (cutâneas e mucocutâneas): roedores silvestres, cães, equinos Visceral: canídeos (doença variável) Amastigotas em macrófagos da pele: importante para transmissão!

PATOGENIA Formas clínicas Leishmaniose cutânea– L. V. braziliensis, L. L. amazonensis, L. V. guyanensis L. L. major Leishmaniose difusa – L. L. amazonensis Leishmaniose mucocutânea –L. V. braziliensis Leishmaniose visceral –L. L. chagasi, L. L. donovani PKDL Novo Mundo Velho Mundo http: //lineu. icb. usp. br/~farmacia/indexdiu. html

Figura pré-colombiana (séc I AC) mostrando os efeitos do “huaco”

Leishmaniose cutânea: geralmente lesões únicas ou limitadas Normalmente (90%) úlceras com bordas elevadas. Linfad local Leishmaniose difusa: rara, múltiplas lesões papulosas ou nodulares (lepra branca), imunocomprometidos Leishmaniose mucocutânea: meses ou anos após lesão cutânea, raramente simultânea (distante ou contígua) Cavidades nasais, faringe, laringe, cavidade oral Infiltradas, com ulceração e perfuração (septo nasal, palato) Leishmaniose visceral: parasitas com tropismo pelo sistema FM do baço, fígado, tecidos linfóides e médula óssea Febre, fraqueza, emagrecimento, hepatoesplenomegalia Sangramento e diarréia

Quadro clínico- forma cutânea localizada L. (V. ) braziliensis L. (V. ) guyanensis L. (L. ) amazonensis L. (L. ) mexicana Evolução clássica: 2 -8 sem após infecção

Quadro clínico- forma cutânea difusa L. (L. ) amazonensis - Anergia da resposta imune - Disseminação da doença (lesões nodulares) e difícil tratamento

Quadro clínico- forma muco-cutânea L. (V. ) braziliensis • Doença crônica, associada a considerável morbidade e estigma social. • Tratamento prolongado e tóxico.

Quadro clínico-forma visceral (calazar) L. (L. ) chagasi L. donovani L. infantum No Brasil, crianças são grupo de risco. QC: febre irregular, perda de peso, aumento de baço e fígado, e anemia. Pele cinza (Índia)= calazar (febre negra) • Período de incubação: 2 a 6 meses • Assintomáticos: 1: 2, 6 -11: 1 no Sudão, 8: 1 -18: 1 no Brasil

Resposta imune Leishmania major

Resposta imune IFNg is uniquely secreted by one subset, designated Thl The other subset, designated Th 2, uniquely releases several B cell growth and stimulatory factors, including IL-4 and IL-5 Resolution of murine leishmaniasis was associated with IFNg and IL-4 are produced reciprocally in resolving or progressive infection in murine leishmaniasis: distinct Th subsets moderate the spectrum of this infectious disease Heinzel et al, 1989

Camundongos: Padrão Th 1 -Th 2 e macrófagos M 1 -M 2 Th 1 e Th 2 M 1 e M 2 Mills et al. , 2000

Modulação da Resposta imune Leishmania major Macrófago infectado Ativação do “burst respiratório” e produção de NO Apresentação de antígenos na superfície cmdg resistente Respostas Th 1 (IL 2, IFN ) Th 2 (IL 4, IL 5) cmdg suscetível Ausência de ativação de macrófagos

Leishmania major pré tto

Homem ≠camundongo, L. amazonensis ≠ L. major Leishmania amazonensis em BALB/C: mixed Th 1/Th 2 response Ji et al, 2002

DIAGNÓSTICO Parasitológico Histopatologia ou citologia: esfregaços de medula óssea/linfonodos. Altamente específico e baixo custo, mas baixa sensibilidade Imunológico Anticorpos Ig. G: IFAT (sens e esp), ELISA (muito sens, pouco esp) , DAT, Western Blot , IHQ Resposta celular: Reação intradérmica (hipersensibilidade tardia) Molecular (PCR) Aspirados de tecidos ou sangue. Sensível e específico, alto custo Medula óssea de cão (Wright. Leishman stain) Pele de cão (imunohistoquímica)

DIAGNÓSTICO Tegumentar: Parasita na lesão (escarificação, aspiração, biópsia) Baixa sensibilidade, cultivo ou inoculação em animal Reação intradérmica=Teste de Montenegro (1926)-48 h Visceral: Punção de baço, fígado, medula óssea (cultivo)- risco Sorologia imprecisa: boa sensibilidade, má especificidade (reação cruzada) e positividade após cura Teste Montenegro negativo (positivo após cura)

DIAGNÓSTICO leishmaniose visceral DAT: aglutinação direta Diluição soro paciente-ag parasitas marcados-aglutinação visível Sensibilidade e especificidade de 94 e 97% r. K 39 strip test- dipstick K 39=kinesin-related protein ELISA adaptado Sensibilidade e especificidade de 94 e 95% (US$1)

TRATAMENTO Antimoniais pentavalentes (Gaspar Vianna, 1913) -Intravenosos ou intramusculares (hospital) -20 dias (cutânea) ou 28 dias (mucosa ou visceral) Bloqueiam quinases da glicólise Resistência na Índia (VL Bihar: 6 -8 x dose curou 1/3) Anfotericina B: interage com ergosterol da membrana do parasita, tornando-a permeável a íons e pequenas moléculas. Ainda não há resistência Pentamidina: altera a estrutura do cinetoplasto e síntese de poliaminas. Resistência na Índia http: //wiz 2. pharm. wayne. edu

Tratamentos disponíveis: Difícil administração, longo, tóxico, caro, resistência • Antimoniais pentavalentes: tóxicos, hospitalização Bastante usados há 70 anos • Amphotericina B: toxicidade, hospitalização • Liposomal amphotericin B (Am. Bisome®): excelente mas caro (US$ 2800/tto), intravenoso • Paromomycin: testada apenas na India • Miltefosine: primeira droga oral, cara (US$200) e teratogênica (proibida para gestantes). Desde 2002 Tratamento ideal: oral, seguro, eficaz, baixo custo, curta duração (~10 dias)

ANTIMONIAIS

PERSPECTIVAS DE CONTROLE 1 -Vetor? Doméstico x Silvestre India: hábitos domésticos (DDT eficaz 1950) 2 -Reservatório? Doméstico x Silvestre Tratamento de cães? Problema diagnóstico, reinfecção e sacrifício. 3 -Paciente infectado: tratamento interfere no controle? Reservatório Vetor Homem (exceção: India) Medidas 2 e 3 requerem diagnóstico preciso da infecção 4 -Mudança de hábitos/habitações, reduzir desmatamento

VACINAS Mecanismos de imunidade protetora após infecção bastante conhecidos- “leishmanização” A vacinação com parasitas de lesão/mortos/atenuados confere considerável proteção Antígenos são relativamente conservados entre spp- gp 63, LACK, PSA 2, TSA/Lm. ST 11, PFR 2, A 2, HASPB 1, vacinas de DNA. . . Resultados pouco animadores! Moléculas da saliva do vetor: proteção para algumas spp Leishmania em algumas spp de camundongo Alternativa: manipulação da resposta imune? Vacina de DNA de Hsp 65 M. leprae reverte resposta Th 2 Th 1

Leishmaniasis vaccine produced in the Razi Institute, Teheran (IRAN) " WHO/TDR/Crump

VACINAÇÃO COM ESPÉCIES NÃO PATOGÊNICAS? Vacinação camundongos BALB/C com L. talentolae: Estimulou maturação de células dendríticas Induziu proliferação de céls T CD 4 produtoras de IFNg- resposta Th 1 Uma imunização: proteção contra L. donovani Teste em humanos?

VACINAS Agência FAPESP – 8/12/1008 O Instituto Butantan e o Instituto de Pesquisas de Doenças Infecciosas (Idri, Seattle, Estados Unidos), anunciaram na última sexta-feira (5/12) que a segunda fase dos testes clínicos da vacina contra a leishmaniose será iniciada no Brasil. O novo complexo vacinal foi produzido por pesquisadores de instituições norte-americanas e brasileiras. A fase 1 de testes clínicos (nos EUA) avaliou a toxicidade da vacina em camundongos e alguns humanos: muito eficaz em camundongos aprovada pelo FDA [Food and Drug Administration]. A fase 2 irá testar a eficiência em cães. “Objetivo: imunizar 75% dos 40 milhões de cães soltos no país. Custo aproximado: R$ 15 milhões”- Isaias Raw, presidente da Fundação Butantã. Vacina profilática em cães e terapêutica em humanos

NOVAS PERSPECTIVAS? Separadas 15– 50 milhões de anos 1% genes espécie-especificos 2008

WHO 1999

VL is the primary disease target for DNDi, CL is secondary 2, 357, 000 DALYs

NEGLIGENCIADOS? Kabul- rejeição