Legionella Legionellose Legionella une bactrie pathogne mergente 4

Legionella Legionellose

Legionella, une bactérie pathogène émergente 4 Philadelphie juillet 1976, 1 e épidémie de pneumonies due à Legionella pneumophila (56 th annual American Legion Convention) 21/180 décès = Maladie des Légionnaires. 4 Janvier 1977, bacille à gram-négatif identifié et nommé L. pneumophila. La source de contamination était le système d ’air conditionné de l’hôtel. 4 Ultérieurement le point essentiel de la maladie des Légionnaires a été la découverte des propriétés de réplication intracellulaire de L. pneumophila dans les macrophages alvéolaires.

ECOLOGIE ET EPIDEMIOLOGIE DE LEGIONELLA • Legionella est retrouvée de manière ubiquitaire dans l ’eau et isolée à partir de nombreuses autres sources environnementales. Bactérie hydrotellurique( eau douce, terre humide, composts…)In vitro exigeante( milieux et durée d’incubation) • Multiplication dans les protozoaires libres (amibes)avec lesquels elle vit en symbiose. Température optimale de multiplication entre 25 et 45°C • Réservoirs artificiels: ECS (collectivités, hôtels…), climatisation humide, TAR, thermes, saunas, bains à remous, fontaines, nébuliseurs, respirateurs, humidificateurs, brumisateurs…

Sources artificielles

EPIDEMIOLOGIE DE LEGIONELLA incidence de la maladie • 0. 5 à 5% des pneumopathies communautaires • Sporadiques ou cas groupés(au moins 2 cas en moins de 6 mois) • Cas groupés : épidémies hôpitaux, hôtels, grands immeubles, émissions extérieures (TAR) • Fréquence saisonnière : pic été/automne • Maladie à déclaration obligatoire(1987) Détection précoce des épidémies Suivi de l’évolution de l’incidence • INVS : 1. 9 cas /100. 000 habitants 20% origine nosocomiale • Lp 95% des cas , 80% Lp 1 • Fièvre de Pontiac: Lp 1, 6, 7, anisa • Toutes les espèces sont potentiellement pathogènes

Modes de transmission • Voie aérienne : Inhalation seule voie démontrée • Contamination par ingestion – Discutée en cas de fausse route • Pas de contamination interhumaine • Pas de contamination manuportée • Pas d’isolement septique de patient atteint

Facteurs de risque individuels • intrinsèques – âge > 50 ans - sexe masculin – Tabagisme - éthylisme – Traitements immunosuppresseurs - maladie sous jacente(diabète, cancer, cardiopathie, affections respiratoires ) • extrinsèques – Exposition +/- prolongée ou fréquente – État du réseau et entretien (détartrage des pommeaux de douche, robinets. . ) – Aérosols, ventilation à domicile

Facteurs de risque collectifs • Hôpitaux, hôtels, campings, stations thermales, centres de loisirs… • Tours aéro-réfrigérantes( émission de nuages contaminés à plusieurs kilomètres) cf circulaires et arrêtés

La bactérie • Eubactérie, legionellaceae, espèce Legionella, espèce type Legionella pneumophila 3 sous espèces: – Lp subsp pneumophila: • Philadelphia 1 et sérogroupes 2 -15 – Lp subsp fraseri : • Los angeles 1(sérogroupe Lp 4) • Sérogroupes 1, 4, 5 et Lansing 3 – Lp subsp pascullei sérogroupe 5 (type U 8 W) – Les « Legionella-like-amoebal-pathogens » LLAPs intracellulaires obligatoires, différentes espèces dans le genre Legionella

Legionella, bactérie à multiplication intra-cellulaire. 4 En 1980, Rowbotham a décrit la capacité de L. pneumophila à se multiplier dans les amibes (protozoaires). 4 Le mécanisme de réplication intracellulaire de L. pneumophila dans les phagosomes des cellules de mammifères et des protozoaires est identique. 4 Il n ’y a pas de fusion du phagosome avec les lysosomes Une association est réalisée avec le réticulum endoplasmique (présence de protéine chaperonne spécifique du RE, la protéine Bip). Au moins 16 gènes sont impliqués dans ce mécanisme (dot. A…).

Infection par LP 1 à 4 et 12 h: A, B H. vermiformis C, D WI-26 humain

Diagnostic biologique • Anomalies non spécifiques • Hyperleucocytose formule inversée (parfois leucopénie et thrombopénie) • Atteinte rénale: protéinurie -hématurie-hyponatrémie – hypophosphatémie • Atteinte hépatique : augmentation de aspartate aminotransférase, PAL, LDH • Atteinte pulmonaire : hypoxémie

Diagnostic bactériologique • Direct – I. F directe sur le prélèvement – Culture – Antigène urinaire – PCR • Indirect – Sérodiagnostic

Immunofluorescence directe • Rapide ( 2 heures) par AC poly et monoclonaux tous les sérogroupes de Lp • Peu sensible(25 -40%) seuil de détection 104 UFC/ml • Peu spécifique(6070%)

• • Antigènes solubles urinaires Précoce 1 à 3 jours Persistance 45 jours ELISA Immunochromatographie Sensibilité 56 à 80% Spécificité 99% Legionella pneumophila 1, 3, 6 selon réactif • Valeur prédictive négative 95% • Valeur prédictive positive 86%

Cultures • Méthode de référence certitude, spécificité 100%, sensibilité 40 à 60% • Aérobie stricte CO 2 (2. 5%) primo isolement • PH 6. 85 -6. 95 tolère p. H 5. 5 • Température 35°C • Exigence en cystéine milieu BCYE cultive en 3 -7 -10 jours(absence de culture sur gélose sang –croissance possible en absence de cystéine par adaptation) • Milieu sélectif avec antibiotiques (céphalotine, colimycine, vancomycine) inhibiteur pour certaines souches

2 1 1 -2 -3 -Legionella pneumophila 4 -legionalla anisa Milieu BCYE 4 3

Examen direct • Coloration de Gram peu ou pas visible non capsulé non sporulé 2 à 20µm / 0. 3 à 0. 9µm • Prélèvement court fin et coccobacillaire • Bacille gram négatif long et filamenteux en culture

Type de prélèvements • Nature –qualité – Respiratoire: LBA - aspirations - expectoration -biopsie pulmonaire -liquide pleural – Localisation extra pulmonaire: sang -liquide péricardique endocardite –myocardite -foie- rate –rein -peau • Stockage – 4°C -si délai> 3 jours congélation – 20°C • Ensemencement – 100µl de prélèvement en direct ou après traitement sur milieux appropriés les biopsies ou tissus au mortier dans de l’ eau stérile • Décontamination – – En cas de contamination bactérienne importante Acidifier par HCl 0. 2 M neutraliser par KOH ou Na. OH 0. 01 M En cas d’échec chauffer 30 mn à 50 °C Dilution des échantillons pour diminuer la contamination et l’effet antibiotique

Identification et différenciation des Legionella • • • Morphologie -Caractères culturaux Caractères biochimiques et enzymatiques Caractères antigéniques Méthodes moléculaires Autres méthodes: – Composition de la membrane cytoplasmique en ubiquinones par chromatographie liquide – Composition de la paroi en acides gras ramifiés par chromatographie gazeuse • Co-culture amibienne

Morphologie • Colonies grises muqueuses polymorphes en verre fritté ( loupe binoculaire 30 fois ) • Lumière de Wood à 366 nm fluorescence pour différencier L. P et d’autres espèces: – Bleue: L. anisa, bozemanii, dumoffi, gormanii, gratiana, cherrii, parisiensis, stegerwaltii, tucsonensis – Rouge : L. rubrilucens, erythra • Autres milieux – pourpre de bromocrésol, bleu de bromophénol = colonies de couleurs variables – Pigments sécrétés « melanin-like » = brunissement du milieu exempt de charbon contenant L- tyrosine ou L- phénylalanine

BCYE- LEGIONELLA PNEUMOPHILA- LOUPE BINOCULAIRE LEGIONELLA BOZMANII- UV

Caractères culturaux ØColonies suspectes repiquées sur 3 milieux: BCYE sans cystéine - Gélose au sang - BCYE: après 48 h à 72 h d’incubation culture positive sur BCYE ØObservation à la loupe binoculaire: aspect en verre fritté

Caractéres biochimiques • • Catalase+ sauf L. worsleinsis Oxydase +/Hippurate + L. pneumophila Gélatine + sauf micdadei feeleii maceabernii • Mobilité + (fagelles polaires ou bipolaires) sauf okbridgensis londiniensis • Test à l’amidon +

Caractères antigéniques • L. pneumophila : LPS, protéine « MOMP » présente chez tous les sérotypes de Lp et spécifique d’espèce et d’autres antigènes protéiques • IFD réactif commercialisé AC monoclonal anti MOMP =différence Lp et Lnp

Caractères antigéniques • Agglutination de particules de latex : LP 1, 2 -15 et Lnp (7 espèces) • Identification finale de 64 sérogroupes : AC de lapin spécifique de chaque espèce et sérogroupe (laboratoires spécialisés)

Méthodes moléculaires • PCR – RAPD : amplification aléatoire de l’ADN – Amplification des espaces intergèniques 16 s -23 s pour Lnp – Séquençage nucléotidique du gène mip, du gène codant pour l’ARN 16 s, 5 s et espaces intergéniques 16 s-23 s

Amplification génique • Prélèvements – Urines, LBA , sérums • Gènes amplifiés – Mip (détection de 50 UFC dans LBA) – Gène rrf correspondant à ARN 5 s ribosomal (genre Legionella) – ARN 16 s • Avantages: rapidité et détection de toutes les espèces de legionella • Critère de définition de cas (en cours de validation)

Diagnostic sérologique • Immunofluorescence indirecte ou ELISA ( screening) • Séroconversion: tardive apparition lente des anticorps • 2 prélèvements ( 4 à 6 semaines d ’intervalle) • Persistance des anticorps 3 à 18 mois • Sensibilité 75% • Spécificité 95% • Sérogroupes autres que LP 1 (épidémiologie)

Tests en pratique de ville • Echec de traitement aux bêta-lactamines à 3 jours => modification, mise en place d’une antibiothérapie active sur germes atypiques. • Antigène soluble urinaire LP 1 (contexte épidémique ou forte présomption ou échec thérapeutique) • Sévérité conduisant à l’hospitalisation

Avantages et dangers de l’AG urinaire • Spécificité LP 1 (faux négatifs autres LP). • Faux positifs exceptionnels(maladie sérique) • Impossibilité de confirmer une épidémie par comparaison des souches cliniques et environnementales • Très rapide. • Systématique à l’hôpital (signes respiratoires survenants en cours d’hospitalisation et absents à l’admission)

Critères de définition des cas • Cas confirmé : Pneumopathie et/ou image radiologique associée à une confirmation – Isolement de Legionella – Immunofluorescence directe positive – Présence d ’antigènes solubles urinaires – Séroconversion : augmentation du titre AC( 4 fois) • Cas possible Pneumopathie et/ou image radiologique associée à – Titre unique élevé 256 quelque soit l’espèce • Les techniques d’amplification géniques vont être incluses dans les critères de définition des cas

Définitions cas groupés • Cas groupés – Au moins 2 cas survenus en moins de 6 mois dans un même lieu d’exposition – Intervalle de temps > 6 mois= cas liés • Cas nosocomial – Certain: patient qui a séjourné 10 jours avant le début des signes cliniques – Probable: patient qui a séjourné au moins 1 jour pendant les 8 jours précédents les signes cliniques

• DASS Déclaration – enquête environnementale du patient • CCLIN – Cas nosocomial à signaler ( DDASS) • CNR – envoyer les souches pour enquête épidémiologique et confirmation du sérogroupe et / ou de l ’espèce ( L. P. 2 -15 et Legionella non pneumophila) – étude épidémiologique • EWGLI – réseau de surveillance européen des légionelloses acquises lors des voyages • INVS

CNR-Glossaire Legionella 2007 • Souches endémiques – Souche Paris(10%) des cas en France diagnostiqués par culture – Souche Lorraine(10%) des cas diagnostiqués par culture – Souche Mondial(épidémie coupe du monde à Paris 1998) endémique en région parisienne

CNR-Glossaire Legionella 2007 • Souches épidémiques – Souche Montparnasse épidémie Paris été 1999 – Souche Rennes épidémie Rennes 2000 – Souche Sarlat épidémie Sarlat 2002 – Souche Montpellier épidémie Montpellier 2003 – Souche Poitiers épidémie Poitiers 2003 – Souche Lens épidémie Lens décembre 2003 et janvier 2004 – Souche Austerlitz épidémie à Paris en 2006

Sensibilité aux antibiotiques traitement • Bêta lactamines: – résistance par secretion de bêta –lactamase • Macrolides: Erythromycine voie orale pour les formes communes en monothérapie • Fluoroquinolones: voie orale pour les formes communes • Traitement formes sévères: associationavec rifampicine voie parentérale