Leccin 1 Introduccin y principios generales ALGUNAS CUESTIONES

Lección 1 Introducción y principios generales

ALGUNAS CUESTIONES BÁSICAS • • • ¿Qué moléculas son los principales “componentes activos” en las células? Las proteínas (enzimas, componentes de sistemas de señalización …) ¿Qué determina la actividad de una proteína? Su estructura 3 D, que viene condicionada por su estructura primaria Dónde está en un organismo, cuándo aparece y cuánto lo hace ¿Puede replicarse una proteína? No, la estructura 1 aria de una proteína no puede pasar de una molécula de proteína a otra. Eso sí es posible en los ácidos nucleicos ¿Dónde está contenida la información sobre la estructura 1 aria de una proteína? En los ácidos nucleicos: en la región codificante de los genes ¿Dónde está contenida la información sobre el dónde, cuándo y cuánto? En los ácidos nucleicos: en la región promotora de los genes y en la estructura de la cromatina ¿Dónde están situados los genes en los eucariotas? En los cromosomas, cada cromosoma es una molécula de DNA lineal que contiene un número variable de genes y suele haber varios cromosomas por célula

ALGUNAS CUESTIONES BÁSICAS • • • ¿Qué es el locus de un gen? La posición dónde se encuentra en un cromosoma ¿Son iguales todas los genes de un determinado tipo presentes en los individuos de una especie? No, suele haber variantes: son los alelos ¿Un carácter, un gen? Para la gran mayoría de los caracteres NO: varias proteínas intervienen en un proceso, su expresión está controlada por otras proteínas y RNAs y su actividad por sistemas de señalización sensibles a cambios ambientales. Por tanto, lo habitual es: un carácter, varios genes + influencias ambientales ¿Controlado genéticamente = inflexiblemente determinado? No siempre, porque la actividad de las proteínas se ve modificada por efectos ambientales ¿Un gen, un carácter? Una proteína suele tener siempre el mismo tipo de actividad pero si cambia el contexto en el que actúa puede hacerlo el efecto final en el organismo. Consecuencia: en muchas ocasiones el mismo gen afecta a diferentes caracteres. Otra posibilidad: un gen da varios productos (“splicing” alternativo)

TIPOS DE GENES EUCARIOTAS -1) Su producto final es una proteína -2) Su producto final es un RNA -r. RNA o t. RNA Transcritos por RNApol específicas Productos estables Tendencia a estar agrupados en el genoma -mi. RNA Transcritos por la RNApol II Productos pequeños e inestables Dispersos por el genoma -lnc. RNA

ALELOS DE UN GEN Mutación Individuos a 1/a 1 a 34 a 16 a 4 a 1/a 12 a 6 a 18 a 2 a 5 a 4/a 8 . . . a 12 a 3 “Pool” de alelos del gen “a” en la especie Deriva Selección negativa

¿GEN → CARÁCTER? Ca 2+ 1 2 3 4 Carácter X: Ca 2+ a b c d e f 7 k TF 1 -P 2 b Señal ambiental CARÁCTER X g Un gen afecta a varios caracteres Un carácter afectado por varios genes Efectos ambientales 5 Gen 2 Genes 1, 2, 3, 4, 5 TF 1 Receptor Señal 3 c d m r 6 CARÁCTER Y Carácter Y: Genes 2, 3, 6, 7 Señal ambiental

“SPLICING” ALTERNATIVO a-tropomiosina Es probable que lo sufra la mayoría de los genes en eucariotas

GENES DELATORES Delator Gen de interés Delator transcripcional ¿dónde se transcribe el gen? Delator traduccional ¿dónde se acumula el producto? ¿Efecto de la cromatina en esa zona del genoma? : inserción dirigida delator lac. Z (β-galactosidasa) GUS (β-glucuronidasa) GFP Luciferasa

¿CÓMO ENTENDER UN FENÓMENO BIOLÓGICO? Atracción por la luz Dos posibles aproximaciones: -1) Extraer proteínas, RNA, metabolitos … de individuos antes y después de entrar en contacto con la luz y buscar diferencias. Problemas: complejidad de los resultados, falta de sensibilidad … -2) Buscar individuos o generar MUTANTES que no se sientan atraídos. Identificar los genes afectados. Problemas: no se encuentren esos individuos, mutantes triviales …

REQUISITO PREVIO En la aproximación genética SÓLO puede estarse seguro de que un gen afecte a un carácter si disponemos de más de un alelo de ese gen: VARIABILIDAD AA AA AA Bb Bb Bb BB BB Bb bb bb bb Cc CC cc ? ? Aa AA aa Bb Bb Bb BB BB Bb bb bb bb CC CC CC Tres genes controlan el carácter en esta especie pero sólo podemos detectar en cada población el efecto de dos (los variables)

¿CÓMO OBTENGO LAS VARIANTES?

¿GENES TAMAÑO OREJAS? -Parto de las variantes que hay ya en la naturaleza (variabilidad natural) -Hago mutagénesis y busco mutantes de interés (“screening”) Mutagénesis

“SCREENING” CLÁSICO Mutagénesis … AL AZAR ¿No mutado? Cada gen puede estar o no mutado en algún individuo. Cuantos más individuos más probabilidad de tener mutaciones en todos los genes Individuos SIN fenotipo de interés SE DESCARTAN ¿Gen no relacionado? Análisis del fenotipo en búsqueda de individuos donde sea de interés Identificación del gen mutado en los individuos con el fenotipo de interés. Algunos genes importantes para el proceso en estudio se encontrarán muchas veces, otros ninguna “Screening” SATURADO: todos los genes que se podían encontrar con el método usado se han encontrado

“GENOME-WIDE SCREENING” Identificar todos Mutarlos genes uno a uno … Su interés radica en que tiene un gen mutado. Otros fenotipados pueden detectar algo Colecciones de interés PÚBLICO SE CONSERVAN Cada gen estará mutado en algún individuo Individuos SIN fenotipo de interés Fenotipar cada individuo Asignación de una función a cada gen SI ES QUE al mutarse origina un fenotipo detectable

GENES → FUNCIONES: DOS ESTRATEGIAS Y DOS APROXIMACIONES

GENÉTICA DIRECTA/ REVERSA Genética directa: del mutante al gen, de la función al gen * Gen afectado Mutante (función del gen) PASOS A SEGUIR: Mapear la región del genoma afectada en el mutante; identificar el gen; clonarlo; comparar secuencias de los alelos wt y mutante Genética reversa: del gen al mutante, del gen a la función Gen Mutante (función del gen) PASOS A SEGUIR: Cambiar la secuencia del gen en el organismo (obtener un mutante); identificar alteraciones producidas; predecir la función del gen

APROXIMACIÓN INDIVIDUAL vs SISTEMÁTICA Mi mutante favorito INDIVIDUAL Genética directa Genética reversa GEN FUNCIÓN Mi gen favorito Individuos wt Mutagénesis AL AZAR SISTEMÁTICA Genoma Mutagénesis DE CADA UNO de los genes “Genome-wide screening” Colección de mutantes (individuos o genes) Genética directa Genética reversa GENES FUNCIONES

¿QUÉ GEN ESTÁ MUTADO?

¿DÓNDE ESTÁ EL GEN AFECTADO EN EL MUTANTE? APROXIMACIÓN CLÁSICA: • ¿En qué cromosoma está? ¿En qué posición en ese cromosoma? Para contestar lo anterior debemos saber cómo se hereda en relación con otros genes de posición ya conocida (MARCADORES): Debemos estimar con qué frecuencia se separa nuestro alelo mutante de alelos de los marcadores a los que estaba asociado, frecuencia de RECOMBINACIÓN Loci situados en distintos cromosomas: 1/2 probabilidad de que se separen Loci situados en el mismo cromosoma: < 1/2 probabilidad de que se separen (tanto menor cuanto más cerca estén) NUEVAS APROXIMACIONES: • • Secuenciar el genoma de individuos estrechamente emparentados con y sin la mutación, comparar las secuencias e identificar los cambios relevantes “Tilling arrays” con DNA de individuos con y sin la mutación

MAPEO CON “TILLING ARRAYS” Región del genoma Oligonucleótidos de la región “Tilling array” Hibridación sondas de DNA wt y mutante con el “array” Hibridación con DNA wt Hibridación con DNA mutante Localización del mutante

MAPEO POR RECOMBINACIÓN Indv 1 Nuestro mutante: m Marcador A/a AAmm Prog 2 aamm X Descendientes recombinantes: se han separado los alelos asociados Indv 2 X aa. MM Prog 1 Am a. M Am a m a. M Alelos A y m asociados en un genomio Alelos a y M asociados en el otro Descendientes parentales: se mantiene los alelos asociados como en el progenitor Frec. Recom ~ 1/2: en distintos cromosomas Frec. Recom < 1/2: en el mismo cromosoma

¿ES LA MUTACIÓN EN EL GEN MAPEADO REALMENTE LA CAUSA DEL FENOTIPO?

RESCATE DE UN MUTANTE C. elegans wt unc-104 Se mueven lentamente y sin coordinación Se quedan paralizados y enrollados UNC-104: : GFP Rescate del mutante, se mueven de nuevo normalmente

¿QUÉ INFORMACIÓN DAN LOS MUTANTES?

¿Cómo se sabe que los productos de estos genes intervienen? ¿Cómo se sabe qué genes están en la misma ruta? ¿Cómo se sabe el orden de actuación de los que están en la misma ruta?

EL VALOR DE LOS MUTANTES El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura wt A B C Mutante D Fenotipo normal A B C* D Fenotipo anormal Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica … El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde y cómo actúan los genes y el orden en que intervienen en un proceso (EPISTASIAS) El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lo hacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura

POSIBLES FENOTIPOS -Un único fenotipo. Esperable si el gen tiene una única función. -Más de un fenotipo (PLEIOTROPÍA). Posibilidades: INTERESANTE: el gen tiene varias funciones en distintos momentos o lugares. MENOS INTERESANTE: hay una relación trivial entre los fenotipos (un mutante causa parálisis y malnutrición porque al no moverse el individuo no puede alimentarse) -No todos los mutantes muestran el fenotipo (PENETRANCIA INCOMPLETA): por cambios aleatorios de expresión alrededor de un valor umbral; por interacciones con otros genes o el ambiente … -No todos los mutantes muestran el fenotipo en el mismo grado (EXPRESIVIDAD VARIABLE) -Sin fenotipo. El gen pasa inadvertido.

DUPLICACIONES GÉNICAS Duplicación Divergencia con el tiempo Dos posibilidades * Actividades del producto ligeramente diferentes Expresión ligeramente diferente de los genes Si muta uno de los genes a veces el otro podrá suplirle: no aparece fenotipo o es débil. Efecto de la REDUNDANCIA

TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de pérdida de función (“loss-offunction”) -Mutantes nulos (“null mutants”) o amorfos (“amorphic mutants”) SUELEN ser recesivos. El arquetípico sería una deleción. Se consideran como muy útiles para determinar la función de un gen. Útiles en estudios de epistasia. -Mutantes de pérdida parcial de función o hipomorfos (“hypomorphic mutants”) SUELEN ser recesivos. Si no se reconocen como tales sus fenotipos pueden dar problemas de interpretación y son nocivos para los estudios de epistasia

Mutante nulo + * + + +/+ m/+ * * * m/m m/Del Mutante hipomorfo + * + + +/+ m/+ * * * m/m Así es recesivo +/+ M/+ m/Del Así es dominante wt wt mutante +/+ Mutante haploinsuficiente (DOMINANTE)

TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-offunction”) -Mutantes sobreproductores (“over-producers”) o hipermorfos (“hypermorphic mutants”) SUELEN ser dominantes. El producto del gen sigue apareciendo en los mismos lugares y momentos. Posibilidades: más expresión del gen; el producto es más estable; producto más activo. . . Útiles para determinar la función de un gen si hay redundancias. Útiles en estudios de epistasia

Mutante sobreproductor + * + + +/+ M/+ Así es dominante +/+ M/+ * * M/M Así es recesivo M/M mutante wt wt +/+ M/M

TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-offunction”) -Mutantes sobreproductores (“over-producers”) o hipermorfos (“hypermorphic mutants”) -Mutantes de expresión ectópica (“ectopic expression”) o neomorfos (“neomorphic mutants”) SUELEN ser dominantes. El producto del gen aparece en sitios o momentos donde no lo hace normalmente. Útiles para determinar la función de un gen si hay redundancias. Nocivos en estudios de epistasia

MUTANTENNAPEDIA EXPRESIÓN ECTÓPICA: mutante dominante (ganancia de función) Segmento anterior como uno posterior: POSTERIORIZACIÓN X Cada región viene especificada por una combinación de genes homeóticos

TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-offunction”) -Mutantes sobreproductores (“over-producers”) o hipermorfos (“hypermorphic mutants”) -Mutantes de expresión ectópica (“ectopic expression”) o neomorfos (“neomorphic mutants”) -Mutantes dominante-negativos (“dominant negative”) o antimorfos (“antimorphic mutants”) El producto del alelo mutante al interaccionar con el normal lo hace funcionar mal. Típico de productos génicos que funcionan en complejos. Como un alelo nulo, pero de efecto dominante.

MUTANTE ANTIMORFO Heterocigoto: produce ambos tipos de receptor Los heterodímeros no son funcionales: puede haber efecto dominante

¿AYUDA TENER VARIOS ALELOS MUTANTES DEL MISMO GEN?

LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS wt No todos los alelos son igual de útiles para estudios posteriores: intensificación, supresión, epistasias, etc Distintos alelos mutantes del mismo gen Distintos alelos pueden afectar a diferentes actividades del mismo gen Gana fuerza la hipótesis de que el gen está implicado en el desarrollo de esa estructura

LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS Este alelo indica que el mismo gen interviene en el desarrollo del ala y la pata Ala * Pata Este alelo indica que afecta más fuertemente al desarrollo del ala que al de la pata * * wt Alelo nulo Alelo hipomorfo

LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS ETAPA II Gen A Antena Gen A Cabeza Alelo nulo de A: no hay cabeza y no se puede llegar a etapa II Detectamos dónde actúa PRIMERO el gen Podemos no detectar dónde lo hace luego

LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS ETAPA II Gen A Antena Gen A Cabeza Alelo hipomorfo de A: problemas en cabeza y antena Podemos detectar los distintos sitios donde actúa el gen

¿TENEMOS MUTANTES DEL MISMO O DE DIFERENTES GENES?

ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN Cruce a realizar: ¿Afectan las dos mutaciones al mismo gen? (deben ser recesivas) m 1/m 1 ¿Fenotipo? SÍ, AFECTAN AL MISMO m 1 m 2 * * m 2/m 2 m 1 m 2 NO, AFECTAN A DISTINTOS X m 1 X wt 1 No hay producto funcional del gen FENOTIPO MUTANTE No hay complementación x * X wt 2 m 2 Hay producto funcional de ambos genes FENOTIPO wt Hay complementación * X

¿CONTROLAN EL MISMO PROCESO ESTOS VARIOS GENES DE LOS QUE YA TENEMOS MUTANTES?

INTERACCIÓN ENTRE GENES La combinación de mutantes en un mismo individuo da PISTAS sobre cómo interaccionan los productos de los genes afectados Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b): -1) Muestra tanto el fenotipo A como el B Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes de Mendel) -2) Fenotipo wt, o casi wt Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes -3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B) Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …) -4) Muestra el fenotipo A o el B Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro. Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.

¿PODEMOS OBTENER INTENSIFICADORES Y SUPRESORES INTENCIONADAMENTE?

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA IMPORTANTE: los efectos son porque se ha mutado OTRO gen, añadido al que ya lo estaba de inicio mutagénesis inicial wt mutagénesis posterior mutante a/a de interés supresor sup/sup; a/a wt mutante supresor intensificador enh/enh; a/a

MUTANTES ESPECIALES

MUTANTES CONDICIONALES T permisiva T restrictiva Producto del gen con problemas → en ciertas condiciones ambientales (restrictivas) se ponen más de manifiesto → aparece el fenotipo mutante Fenotipo wt Fenotipo mutante ¿Cuándo se necesita el producto del gen? Utilidad: Mantener individuos mutantes para un gen esencial

MOSAICOS -/- Muere ¿? ¿? ¿Dónde o cuándo se necesita la actividad de un gen? ¿Qué problemas causa la falta de actividad de un gen en cada sitio o momento? ¿Se necesita su actividad en las células en que se expresa o en otras diferentes? : mutantes autónomos o no autónomos No autónomo Autónomo Fen. mut Fen. wt Fen. mut

ORGANISMOS MODELO 1) Hay millones de especies vivientes, muchas tendrán interesantes características, pero no hay recursos para estudiar todas en profundidad. 2) Dependiendo del nivel a que se estudien, habrá cosas que tengan en común muchas especies: “Lo que es válido para E. coli debe serlo para los elefantes” (Monod, 1954) 3) Principales características que debe cumplir una buena especie modelo en estudios genéticos y genómicos: a) Fácil de mantener en el laboratorio e individuos no muy grandes. b) Produce muchos descendientes en poco tiempo. c) Fácil obtener e identificar mutantes y hacer cruzamientos entre individuos de forma controlada. d) Se pueden clonar genes siguiendo protocolos “típicos” así como reintroducirlos en individuos (transgénesis). e) Se ha determinado la secuencia de su genoma. 4) Especies modelo eucariotas más típicas para estudios genéticos y genómicos:

ORGANISMOS MODELO Saccharomyces cerevisae Colonias en 2 días Mal para señalización Caenorhabditis elegans Ciclo vital 4 dias Transformación dirigida difícil Mus musculus Ciclo vital en 60 días Problemas de espacio Drosophila melanogaster Ciclo vital en 7 -10 días Transformación dirigida difícil Arabidopsis thaliana Ciclo vital en 42 días Transformación dirigida difícil Zea mays Ciclo vital en 120 -150 días Transformación complicada Danio rerio Ciclo vital en 90 días Aún no ampliamente usado Oryza sativa Ciclo vital en 100 -120 días Transformación complicada

DIAPOSITIVAS SÓLO PARA RECORDAR NOCIONES BÁSICAS APRENDIDAS EN UN CURSO DE GENÉTICA

GENES CON LOCI EN DISTINTOS CROMOSOMAS

MEIOSIS DE UN DIHÍBRIDO b B a A Segregación INDEPENDIENTE de cada pareja de cromosomas homólogos Probabilidad: ½ Combinaciones parentales 1/2 * (1/4 +1/4) = 1/2 Probabilidad: ½ 1/4 1/4 Combinaciones recombinantes 1/2 * (1/4 + 1/4) =1/2 1/4 (RF = 50%) 1/4

CRUZAMIENTO PRUEBA DE UN DIHÍBRIDO 1/4 1/4 Proporción 1: 1: 1: 1 RF = 50%

GENES CON LOCI EN EL MISMO CROMOSOMA (GENES LIGADOS)

EFECTO DEL SOBRECRUZAMIENTO ENTRE LOS LOCI Sólo con sobrecruzamiento Sólo se DETECTAN si ocurren ENTRE dos loci HETEROCIGOTOS Sin sobrecruzamiento no hay gametos recombinantes para los loci en el MISMO cromosoma

TIPOS DE DIHIBRIDOS DE GENES LIGADOS Ligados en fase de ACOPLAMIENTO (CIS) Ligados en fase de REPULSIÓN (TRANS)

CRUZAMIENTO PRUEBA DE UN DIHÍBRIDO CIS Si hay SIEMPRE sobrecruzamiento entre esos dos loci (frec. sobrec = 100%) se obtiene 50% de gametos recombinantes (1/4 + 1/4), es decir, RF= 50% = RF < 50% Recombinantes desde un trans Parentales desde un trans Si RF=1% los loci están separados 1 c. M y CADA uno de los dos tipos de gametos recombinantes aparece en proporción de 0. 5%

DISTANCIA GENÉTICADISTANCIA FÍSICA Pocos sobrecruzamientos en la heterocromatina. Poca distancia en el mapa genético pero mayor distancia física Zona con muchos sobrecruzamientos. Distancia genética desproporcionada Por término medio en humanos 1 c. M equivale a 105 -107 pb. En levaduras 1 c. M equivale a unas 6000 pb

LA RF NUNCA SUPERA EL 50% Aunque los loci en estudio estén muy alejados y siempre haya sobrecruzamientos no puede haber más de un 50% de recombinantes Meiocitos con más de un sobrecruzamiento también dan como máximo 50% de recombinantes Entre dos loci no se puede distinguir si ha habido sobrecruzamientos simples o múltiples: se subestima la distancia y se subestima tanto más cuanto más alejados estén. Solución: loci intermedios