LABORATORIO EN LA EVALUACION HORMONAL HOSPITAL CIVIL DE

LABORATORIO EN LA EVALUACION HORMONAL. HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA FRAY ANTONIO ALCALDE. DR. MIGUEL ANGEL POLANCO PREZA. SERVICIO DE ENDOCRINOLOGIA.

INTRODUCCION. § La practica de la endocrinología requiere métodos de laboratorio de precisión: § Pequeños cambios en los niveles hormonales o marcadores moleculares son indicadores precoces de enfermedad, incluso antes que los síntomas físicos aparezcan. § Los métodos analíticos para evaluar los problemas endocrinos están continuamente en expansión; las mediciones tradicionales de factores endocrinos, proteínas, hormonas esteroideas están siendo complementadas por una amplia gama de biomarcadores, particularmente con respecto a los cánceres endocrinos.

INTRODUCCION. § La comprensión de los principios básicos de los métodos y el control de calidad son esenciales para que los médicos puedan evaluar la fiabilidad de los resultados y trabajar eficazmente con el laboratorio para conciliar los valores de una prueba con la presentación clínica. § Las pruebas de laboratorio que se practican hoy en día contribuyen significativamente y de manera directa al costo de la atención. § Los médicos y los patólogos están obligados a comprender el funcionamiento de la medicina de laboratorio y trabajar en equipo para determinar estrategias óptimas de gestión para contener los costos de la atención sin comprometer la calidad.

GENERALIDADES. La endocrinología es una rama medica altamente dependiente de la precisión de las mediciones de laboratorio.

CICLO PARA LA REALIZACION DE UN EXAMEN DE LABORATORIO.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • FASE PREANALÍTICA • Correcta elaboración de la solicitud analítica: • Legible. • Datos mínimos imprescindibles (edad, sexo, fecha de la solicitud, numero de identificación) y datos complementarios (juicio clínico, semanas de embarazo, día del ciclo en caso de hormonas sexuales en mujeres, medicación).

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Preparación del paciente: • Ayuno: se aconseja de forma generalizada; en algunos casos se puede beber agua. • Alcohol: altera la concentración de lactato, ácido úrico, enzimas hepáticas. Se sugiere evitarlo por lo menos 24 horas antes de la toma del examen. • Tabaco: contraindicado si se piden catecolaminas, cortisol, ácidos grasos. • Ejercicio físico: altera los niveles de enzimas musculares como la creatinfosfoquinasa (CPK). • Estrés: puede alterar los resultados de diversos análisis.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Preparación del paciente: • Dieta: algunos parámetros requieren restricciones o cambios en la dieta previos a la determinación. Ej. Aclaramiento de creatinina: no tomar exceso de carne. • Supresión de la medicación: para el aclaramiento de creatinina suprimir por ejemplo antiinflamatorios no esteroideos. • Edad: los resultados pueden variar de acuerdo a esta. • Grupo étnico: diversos trastornos tienen una frecuencia incrementada de acuerdo a la raza. • Embarazo: altera una gran variedad de parámetros de laboratorio.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Obtención de la muestra: • Extracción de sangre: en posición sentado o recostado. • Recolección de orina de 24 horas: algunos parámetros requieren condiciones de acidez por lo que habrá que añadir un ácido al recipiente de recolección (Ej. El 5 hidroxiindolacético, aldosterona en orina, etc). • Niveles de fármacos: hay que tener en cuenta la hora de la administración. Se suelen tomar las muestras 3 -4 horas antes de la siguiente dosis. Hay casos particulares. • Ritmo circadiano: hay que tenerlo en cuenta para algunas sustancias como ACTH y cortisol.

MUESTRA. • • Ambiente toma de muestra. Verificación de instrucciones adecuadas. (Verbales y escritas) Identificación paciente/ muestra. Tipo de muestra (arterial o venosa). Cantidad de muestra requerida. Posición cómoda Limpieza del brazo (isopropanol 60%) Selección del sitio de punción (mediana cubital y mediana cefálica, no venoclísis, no hematomas). • Torniquete (No mas de un minuto y quitarse tan pronto fluya la sangre, no apretado). • Materiales adecuados (Aditivos, jeringa, tubos, agujas). • Anticoagulantes (EDTA, heparina).

TIEMPO DE MUESTREO. • En los sistemas biológicos ocurren cambios siguiendo ritmos bien definidos. • Ritmo menstrual (28 días): importante para determinación de hormona luteinizante (LH), estrógeno y progesterona. • Ritmo circadiano (24 horas): afecta a la mayoría de las hormonas como los corticosteroides. • Pruebas dinámicas (programadas a cierto tiempo después del estímulo). • Monitoreo de drogas. • Muestras microbiológicas. (antes de terapia antimicrobiana).

MANEJO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE. • Intervalo de tiempo entre la obtención y el análisis. • La evaporación de la muestra. • Exposición a la luz (bilirrubinas, porfirinas, vitamina A). • Descomposición de ciertos analitos con el tiempo. • Temperatura ambiente, refrigeración, congelación.

INTERFERENCIAS. • Contaminación (tapones, tubos mal lavados). • Separadores de suero (a temperaturas mayores de 25 grados o mayores velocidades de centrifugación el gel puede descomponerse, no se recomienda para determinación de hormonas). • Descomposición de la muestra debido a altas temperaturas.

CRITERIO DE RECHAZO DE UNA MUESTRA. • Identificación inadecuada. • Volumen inadecuado. • Uso de tubo inadecuado. • Hemólisis. • Transporte inadecuado.

CALIBRACION. • Ajustar un instrumento utilizando valores conocidos (calibradores) para establecer una relación matemática predecible entre el valor verdadero del analito y el resultado del instrumento. • CALIBRADOR. • Posee un valor asignado que tiene una trazabilidad previamente determinada por el fabricante o casa comercial. • Se utiliza para estandarizar el método y nos permite calcular los valores de las muestras y garantizar su precisión.

• ETAPA ANALÍTICA.

ETAPA ANALÍTICA. • FUENTES DE VARIACIÓN: • • Reactivos. Material y limpieza. Medición de volúmenes. Mezclado. Tiempo y temperatura de reacción. Interferencia/especificidad. Instrumentos (manejo adecuado, mantenimiento, estabilidad electrónica, resolución óptica).

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • FASE ANALÍTICA: • TÉCNICAS ANALÍTICAS: son los diferentes procedimientos de análisis basados en el comportamiento de una muestra ante influencias físicas o quimicas: • Espectrofotometría: – Electroforesis. • Cromatografía – Electroquímica. • Química seca – Inmunoensayos.

MEDICION DE HORMONAS.

Medición de hormonas. • Para la determinación de hormonas y sus metabolitos pueden utilizarse diversos métodos: • Químicos. • Espectrofotométricos. • Cromatográficos. Evolución de las Mediciones Hormonales. • Desarrollo de métodos competitivos. • Desarrollo de métodos no competitivos que utilizan Acs. Monoclonales -Mejoramiento en especificidad • Incorporación de señales no radiactivas de alta actividad específica- Aumento de sensibilidad. • Introducción de sistemas automáticos de procesamiento.

Métodos de medición de hormonas. • Históricamente los métodos de laboratorio en la practica de la endocrinología median los niveles periféricos de las hormonas o metabolitos urinarios de las mismas. Estas mediciones se constituyen en verdaderos desafíos analíticos ya que las concentraciones de diversas hormonas son mucho mas bajas que otros elementos que se analizan de manera rutinaria. Por lo que se requirió el desarrollo de técnicas que puedan medir unidades molares, unidades de masa o unidades estandarizadas. • Sensibilidad: mínima concentración medible. • Especificidad: reconocimiento de la molécula a medir.

Inmunoensayos. • Inmunoensayos: • Son un conjunto de técnicas inmunoquímicas que tienen en común el uso de complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, para la cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis) determinado en una prueba o ensayo químico. • La técnica se basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antígenos específicos - anticuerpos monoclonales (obtenidos en el laboratorio) o de sueros policlonales (obtenidos de animales). • Esta afinidad permite la cuantificación de compuestos presentes en líquidos orgánicos en una concentración reducida, del orden de nanogramos/ml o de picogramos/ml. • El desarrollo del inmunoensayo ha tenido gran impacto en el campo del diagnóstico médico mediante pruebas de laboratorio o química clínica.

Inmunoensayos. • Tipos. • Por la técnica de medición: • Competitivo: el antígeno (Ag) objeto de la medición compite con un antígeno marcado por un anticuerpo (Ac). Se mide por la cantidad del antígeno marcado sin conjugar que se considera es inversamente proporcional al analito. • No competitivo: ( tipo sándwich): el Ag de la muestra reacciona con dos Ac diferentes que se fijan a distintas partes del Ag. Uno de los Ac generalmente está en soporte sólido para facilitar la separación de la fracción ligada, y el otro Ac lleva la marca. Se mide por la cantidad del marcador considerando que es directamente proporcional a la cantidad del analito. • Por el medio donde se realiza la medición. • Homogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y el anticuerpo se mide directamente en el mismo medio que se utiliza para favorecer la formación del complejo inmune.

Inmunoensayos. • Heterogéneo: en este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y el anticuerpo se mide en un medio diferente que el utilizado para la unión del complejo inmune, generalmente implican una etapa intermedia de lavado para eliminar interferencias. • Por el marcador. • Radioinmunoensayo (RIA) : el marcador es un isótopo radioactivo. • Enzimoinmunoanálsis (EIA) : el marcador es una enzima como por ejemplo la técnica de enzimoinmunoensayo conocido por su abreviatura ELISA. • Fluoroinmunoanálisis: el marcador es una molécula fluorescente, por ejemplo FPIA. • Ensayo Inmunoquimioluminiscente: la marca es en general una enzima capaz de catalizar una reacción quimioluminiscente. Son tanto o más sensibles que los radioinmunoensayos, y no presentan riesgos de manipulación de sustancias radioactivas.

METODOS BASADOS EN ANTICUERPOS. § Inmunoensayos clásicos de unión competitiva. Los tres componentes básicos de un inmunoensayo competitivo son el anticuerpo, el analito marcado y el analito no marcado. § El término ensayo de unión competitiva se refiere a un método de medición en el que un analito (por ejemplo, una hormona o biomarcador) de una muestra compite con el analito del reactivo marcado por un número limitado de sitios de unión en una proteína de unión.

INMUNOENSAYOS CLÁSICOS DE UNIÓN COMPETITIVA. • El principio básico de esta metodología es permitir que se establezca una condición de equilibrio o estado estacionario entre un analito etiquetado y el analito no marcado. • Si las concentraciones de anticuerpo y el analito marcado se mantienen constantes, la cantidad de analito marcado unido es inversamente proporcional a la concentración del analito no marcado competidor.

INMUNOENSAYOS CLÁSICOS DE UNIÓN COMPE TITIVA. • Actualmente los radioinmuno-ensayos siguen siendo de gran utilidad en la investigación y son ampliamente utilizados como pruebas en la evaluación de la endocrinología, particularmente en los sistemas completamente automatizados.

Sistemas de Medición. • • • Marca Radioactiva: RIA/IRMA • Marca Enzimática: EIA/ELISA • Marca Fluorescente: FIA/IFMA • Marca Quimioluminiscente: QLIA/ICMA

RADIOINMUNOANÁLISIS. • Es una técnica inmunológica propuesta en 1959 por Yallow y Berson, que tiene una gran aplicación en clínica. • Permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el organismo en concentraciones tan bajas (como ng/ml (nanogramo=10 -9 g) o incluso de pg/ml (picogramo=10 -12 g), incluso hacerlo en mezclas con enormes cantidades y diversidad de materiales extraños, por lo que no es necesario purificar previamente la muestra.

FUNDAMENTOS. • El radioinmunoanálisis se basa en una reacción antígenoanticuerpo. Los anticuerpos deben ser específicos contra la substancia queremos determinar y debe tener una gran afinidad. La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada, e inferior a la cantidad de antígeno total. Por lo que va a quedar saturado con él. El antígeno es la hormona (de la muestra) queremos determinar, (antígeno frío). Además de la hormona a medir, se va a añadir una cantidad constante y conocida de antígeno marcado (antígeno caliente).

FUNDAMENTOS DE RADIOINMUNOANALISIS. Los antígenos marcados se forman sustituyendo alguno de sus átomos por los isótopos radiactivos (H 3=tritio, P 32), o introduciendo radioisótopos extraños en la molécula (yodo=I 125). Los dos tipos de antígenos, frío y caliente, van a competir, en igualdad de condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible. La radiactividad total en el tubo permanece constantes y después de la reacción, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la radiactividad en una de ellas. Las concentraciones del antígeno marcado y del anticuerpo son constantes, la única variable del sistema es la concentración de antígeno no marcado (muestra problema). Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la muestra problema, este desplazará al antígeno caliente y por tanto se fijarán al anticuerpo Las fracciones libres, constituidas por antígeno frío y antígeno marcado y las fracciones ligadas formadas por complejos antígeno-anticuerpo y antígeno marcado-anticuerpo. La formación de complejos radiactivos (Ag*-Ac) varía en función de la concentración del antígeno no marcado: a mayor concentración de antígeno no marcado, mayor formación de complejos antígeno-anticuerpo no marcados, y menor formación de complejos radiactivos, y viceversa.

• ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA).

ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA) • Son técnicas inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones antígeno -anticuerpo como en el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima en vez de con un isótopo radiactivo. • La cuantificación se hace por tanto, basándose en la medida de la actividad del enzima marcador. • Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, se añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática con ayuda de un espectrofotómetro. Esta medida de la actividad sirve para calcular la concentración de la molécula problema.

ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA). • Las técnicas enzimáticas presentan numerosas ventajas respecto al radioinmunoanálisis (RIA): • No utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulación y evita la necesidad de instalaciones y licencias específicas. • Reactivos de larga duración. • Posibilidades de automatización. • Gran sensibilidad. • Los EIA pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos. • Ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las sustancias reactantes de medir la actividad enzimática. • Ensayos heterogéneos sí necesitan la separación física de los reactantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinación de la actividad de la enzima marcador.

ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA). • Fundamento: • Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la marcada con la enzima. • Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad. • A mayor concentración de la molécula problema, menor cantidad de antígeno marcado se unirá al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antígeno marcado libre. • A mayor concentración mayor actividad, sin necesidad de separar las fracciones.

ELISA.

ELISA. • ELISA es una variedad del EIA en la que se utiliza una fase sólida como método de separación y recibe el nombre de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). • ELISA tipo sándwich: Es la variedad de ELISA más utilizada y que da mejores resultados. § Reactivos: - Anticuerpo monoclonal ligado a la fase sólida y Anticuerpo monoclonal marcado con la enzima. Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra determinantes distintos del mismo antígeno, lo que permite que los dos se puedan unir al antígeno al mismo tiempo, pero por sitios diferentes. § Los anticuerpos específicos se encuentran unidos a la fase sólida (V. g. la pared del tubo de análisis), de forma que toda la hormona presente en la muestra problema reacciona con ellos quedando inmovilizada. § A continuación se lava el tubo para eliminar el resto de moléculas sin interés (no unidas). § Se añade el resto de anticuerpos marcados con el enzima. Estos anticuerpos también se unen al antígeno del complejo inmovilizado. § Tras otro lavado que elimina el exceso de anticuerpo marcado no unido, se añade el sustrato y se cuantifica la reacción. La formación de producto será

ELISA Competitivo (1)

ELISA Competitivo (2)

ELISA Competitivo (3).

ELISA Competitivo (4)

ELISA Competitivo (5)

ELISA Competitivo (6)

ELISA Competitivo (7)

ELISA Competitivo (8)

ELISA Competitivo (9)

ELISA Competitivo (10)

• FASE POST ANALITICA.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • FASE POSTANALÍTICA: • Es el conjunto de procesos que van desde la obtención de los resultados analíticos hasta que el clínico solicitante tiene el informe de resultados. Es una fase compleja pero decisiva para cumplir una calidad total. • Validación de resultados: • Valoración técnica: es la aceptación de los resultados obtenidos por las distintas técnicas. • Valoración clínica: los resultados deben ser coherentes con la clínica. • Informe de resultados: deben ser claros y precisos. • Tiempo de respuesta: es el tiempo que transcurre hasta que se entregan los resultados al médico solicitante. Debe ser lo más corto posible, sin sacrificar la calidad. • Teoría de los valores de referencia: son intervalos de normalidad de los resultados, los límites superior e inferior no son rígidos (se pueden usar los valores anteriores del propio sujeto aunque normalmente no se tienen datos suficientes).

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Variabilidad de los resultados analíticos: • Variaciones analíticas: toda determinación analítica está sometida a una variación que se denomina “error analítico” • Variaciones extraanalíticas: pueden ser fisiológicas, tanto interindividuales como intraindividuales.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Programa de Control de Calidad: • Objetivos: • 1. Asegurar que los datos producidos por un determinado método analítico son científicamente válidos además de tener precisión y exactitud. • 2. Evaluar de forma real la capacidad funcional habitual de un laboratorio con respecto a otros. • 3. Identificar problemas a medida que surgen. • 4. Resolver los problemas.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Concepto de Exactitud y Precisión: • Exactitud: es el acercamiento de un resultado o de la media de un grupo de resultados al valor verdadero. • Precisión: es el grado de concordancia entre medidas repetidas de una misma muestra, es decir, está relacionada con la dispersión que tiene varias determinaciones de una misma muestra. • El valor numérico que define la precisión es la Desviación Estándar: • Y también se define por otro valor, que es el Coeficiente de Variación: • Para calcular la SD se deben determinar como mínimo 20 mediciones sucesivas del parámetro en cuestión. • El 95% de los resultados deben encontrarse entre los siguientes valores: • X ± 2 SD • En la práctica X ± 3 SD • La SD expresa la amplitud de la variación de los resultados de tal manera que ésta se debe sólo a errores aleatorios y los valores se distribuyen como una curva normal o de Gauss:

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Tipos de errores experimentales: • Errores Sistemáticos: son de causa ajena a lo que es el propio método en sí. Afectan tanto a la exactitud como a la precisión. Estos errores no deben existir, siempre que se de uno hay que buscar las causas y evitarlo. • Errores Aleatorios: rigen la precisión del método y dependen del propio método. No se pueden evitar.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Control de calidad interno basado en el empleo de muestras control. • Selección de las muestras de control de calidad: se emplean preparados comerciales de referencia que son liofilizados. • Gráficos control: hay distintos tipos, el más extendido en el LDC es el “gráfico de Levey. Jennings”, en el cual los resultados de control son expresados en el eje de ordenadas con respecto al tiempo o a las determinaciones sucesivas en el eje de abscisas. • Se introduce la muestra control una vez al día o una vez por turno de trabajo. • En la gráfica se anota el valor medio esperado que es el valor que resulta de la media de todos los valores de las muestras de referencia analizadas, para evaluar la precisión del método. • En el caso de la exactitud será el valor medio que tiene la muestra control cuando es suministrada por el Laboratorio de referencia.

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICOS. • Control de calidad externo: • Tiene como objetivo principal conocer la comparación de los resultados analíticos de diferentes laboratorios. En la actualidad existen 2 tipos de programas: • Programas de vigilancia o pruebas de eficacia, en las que gran número de laboratorios analizan las mismas muestras varias veces al año. • Programas de control de calidad regional, en los que un grupo de laboratorios de una región emplea los mismos lotes de muestras control para su programa de calidad interno. Se analizan durante un periodo de tiempo y los resultados son enviados periodicamente para evaluación. Éste compara el valor medio y la SD con los otros laboratorios.

ERRORES ANALITICOS.

Interferencia Analítica (IFCC). • Error sistemático de la medición, causado por un componente de la muestra, que por sí mismo no produce una señal en el sistema de medición.

Errores analíticos.

Errores analíticos.

¿Cuándo sospechamos Interferencia? • Cuando existe discordancia entre resultados y datos clínicos de los pacientes. • Interferencias en los Inmuno-ensayos: • • Reacción cruzada Autoanticuerpos Anticuerpos Heterófilos/HAMA Factor Reumatoideo

Desafíos en el laboratorio de endocrinología. • Evolución de las mediciones hormonales. • Características de endocrinología. los • Interferencias – Limitaciones. • Variabilidad de resultados. métodos utilizados en

CONCLUSIONES. • Las determinaciones hormonales son fundamentales para el diagnostico preciso en las enfermedades endocrinas. • La coordinación estrecha entre laboratorio y medico son muy importantes para el buen funcionamiento del equipo multidisciplinario.

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