Laboratorio 9 Familia Enterobacteriaceae Mtodos de Identificacin Rpida

Laboratorio 9: Familia Enterobacteriaceae Métodos de Identificación Rápida Biol: 3725 L

Quiz 8 I. Mencione 3 géneros (1, 2, 3) de bacterias que son parte de la flora normal de la garganta, y 2 (4, 5) géneros de la piel. II. Mencione 3 (6, 7, 8) factores que determinan el tipo de microbiota en humanos. III. Mencione 2 (9, 10) beneficios de la flora normal.

Objetivos v Conocer los métodos rápidos para la identificación de bacterias (API 20 E, Enterotubo II, Biolog y Vitek). v Inocular un desconocido en varias pruebas bioquímicas v Tomar datos de las reacciones bioquímicas después de 24 horas de inoculación.

Características generales de la familia Enterobacteriaceae v Bacilos (o coco-bacilos) v Gram negativos v v v Flora normal del intestino de animales de sangre caliente. v Catalasa positivos v Oxidasa negativos v Causantes de enfermedades nosocomiales. v Patógenos humanos más comunes. No producen esporas Temperatura óptima entre 32° 45. 5°C. v Anaerobios facultativos. v Algunos producen cápsula. v Algunos fermentan lactosa. v Pueden ser mótiles (flagelo).

Miembros de la Familia Enterobacteriaceae v v v Citrobacter sp. Enterobacter sp. Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Escherichia sp. Klebsiella sp. Morganella sp. Proteus sp. Shigella dysenteriae Yersinia pestis Providencia sp. Salmonella sp. Serratia sp. Shigella sp. Serratia marcescens Yersinia sp. Klebsiella pneumoniae

Miembros de la Familia Enterobacteriaceae n Los géneros patogénicos más comunes se clasifican en tres grupos n Coliformes: bacilo, Gram -, fermentan lactosa a gas y acido, microbiota normal, pueden ser patógenos oportunistas. n No coliformes oportunistas: no fermentan lactosa. n Patógenos verdaderos

Enfermedades Gastrointestinales n Tracto urinario n Meningitis n Septicemia n Pneumonia n

Modo de Transmición n Alimentos contaminados n Persona a Persona n Agua contaminada n Contacto con animal n Ruta Oral

Propiedades virulentas de E. coli n Enterohemorrágico n Diarrea en humanos, bovinos, gatos y perros. n Escherichia coli O 157: H 7 n Clasificada de acuerdo a sus antígenos somáticos (O) y flagelares (H). n Tolerancia acídica (p. H bajo) n Tolerante a muchos antibióticos

Escherichia coli O 157: H 7 n Causa principal de colitis hemorrágica o diarrea con presencia de sangre. n Puede progresar a Síndrome Urémico Hemolítico. n n Afecta riñones Puede causar Púrpura Trombocitopenia Trombótica n n n Moretones Disminución de plaquetas (trombocitos) Trombos (coágulos en los vasos sanguíneos

Métodos rápidos de identificación de la Familia Enterobacteriaceae

Métodos rápidos de identificación n n API 20 E (Analytical Profile Index) Provee muchos resultados de una sola inoculación. n 20 microtubos con sustratos deshidratados (rehidratación con suspensión de bacteria) n Se pueden identificar 127 géneros y 550 spp. diferentes Bacterias oxidasa-negativo n Gram-negativo de la familia Enterobacteriaceae y otros Gram - API 20 E n Incubar a 35 -37ºC 18 -24 hrs

API 20 E Provee lectura de 22 pruebas bioquímicas n Utilización n n Se genera anaerobiosis con aceite mineral estéril en pruebas cuyas siglas están subrayadas: n Ej. n ADH, LDC, ODC, etc Las pruebas marcadas con un recuadro inferior, se deben llenar completamente: n Ej. CIT , VP , etc.

Procedimiento de API 20 E n Preparación de la suspensión n Inocule una colonia (2 -3 mm diámetro) del cultivo puro de su bacteria en solución salina 0. 85% n Asegúrese que la suspensión sea homogénea.

Procedimiento de API 20 E • Luego de hacer la suspensión inocular los microtúbulos de API 20 E • Añadir 5 ml de agua en la bandeja de incubación para proveer atmósfera húmeda.

Como llenar los microtúbulos

¿Como se lee el API 20 E? n n n Aminoácidos analizados son (en orden) arginina, lisina y ornitina. n Decarboxilación: reacción alcalina (cambio de color a rojo) Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramanosa, sacarosa, melibiosa, amygdalina y arabinosa. n Fermentación: reacción ácida (cambio de color a amarillo) Producción de H 2 S e hidrólisis de gelatina (cambio a color negro en todo el microtubo).

Interpretación del API 20 E n Apuntar los resultados en la tabla de tabulación (1, 2, o 4 puntos para reacciones +, 0 puntos para reacciones -). n La prueba de oxidasa debe ser negativa. n Tres pruebas son añadidas a la vez para dar un código de 7 dígitos (profile index number), el cual es interpretado en el manual de códigos.

Ventajas de API 20 E n Rápido n Eficaz n Permite realizar numerosas pruebas a la vez Desventajas de API 20 E n Solo para microorganismos no fastidiosos. n Cepas Gram negativas y oxidasa negativa. n Bacterias de la Fam. Enterobacteriaceae. n De encontrarse Salmonella o Shiguella spp. , es necesario llevar a cabo pruebas serológicas para confirmar la identificación.

API 20 E Resultados para diferentes miembros de la Familia Enterobacteriaceae

Sistema de Enterotubo II n Identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae, fermentadoras de glucosa y que son oxidasa negativa. (Salmonella, Yersinia, Escherichia etc. ) n Algunas de las pruebas usadas en este sistema son: Simmon Citrate, Triple Sugar-iron agar, ureasa entre otros.

Sistema de Enterotubo II n n n Tubo con 12 compartimentos, cada uno con un medio de cultivo sólido diferente. 15 pruebas estándar preformadas: n Aerobia y anaerobias Se inocula con una aguja, que se pasa por el centro de los compartimentos Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC (oscuridad) Desventajas n Poco preciso n Riesgos de contaminación de las pruebas n Se diagnosticaban erróneamente géneros de bacterias

Sistema Enterotubo II n Lectura n n Observar cambios de color Identificación: n n Estructurar un código de 5 dígitos (Biocode) Consultar con el manual ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding and Identification System for Enterotube)

Sistemas Computarizados n VITEK n n n Identificación y/o determinación de reacción antibiótica de bacterias y levaduras anaerobias (más de 300 especies). 30 pozos con pruebas bioquímicas deshidratadas. Identificación en 2 a 7 hrs. La automatización aporta mayor seguridad, suprimiendo las manipulaciones repetitivas. Una vez inoculada, queda herméticamente cerrada y por lo tanto es manipulable sin riesgo de contaminación. No es necesario añadir ningún reactivo, lo cual evita cualquier riesgo de olvido o error.

Sistemas Computarizados n Inoculador / Sellador n El cual permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos. n Incubador / Lector n Asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas para una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo. n Ordenador n Efectúa un control permanente de las operaciones en curso, memoriza los valores, trata e interpreta los resultados. n Impresora

Sistemas Computarizados n BIOLOG: n Identificación de 1900 bacterias, levaduras y hongos en base a su capacidad enzimática. n Sistema de microplacas de 96 fosas cada una conteniendo una fuente única de carbono, nutrientes básicos y un indicador colorimétrico. n El indicador colorimétrico que utiliza este sistema es una sal de tetrazolium que en su forma oxidada es incolora. n Cuando el organismo es introducido en la gran variedad de sustratos de carbono en la microplaca se produce una huella con un patrón característico. n Los resultados bioquímicos de la muestra son leídos y guardados en segundos automáticamente, eliminando la subjetividad visual de la interpretación.

Sistemas Computarizados n BIOLOG: n Posteriormente son comparados con la extensa base de datos para su identificación final. n Los resultados se interpretan y se registran automáticamente. n Especie identificada se exhibe en un monitor de la pc junto con su patrón de la reacción. n n También una lista de 10 especies con los patrones relacionados más cercanos y otra estadística útil. La tecnología de Biolog es tan sensible que puede detectar cultivos mezclados o contaminados.

Práctica

Instrucciones n Escoja una colonia de la placa de MSA o de Mac. Conkey Seguir instrucciones del instructor. n Haga las inoculaciones y actividades que le sugieren los flujogramas. n Incubar a 37ºC/24 hrs. n Observar sus resultados y anotarlos. n Recuerden traer su vaso de recolección de orina para la próxima semana!!

Mac. Conkey Lab # 9: Familia Enterobactericeae e identificación de desconocidos morfología coco bacilo Métodos rápidos de identificación API 20 E Enterotube Vitek Biolog Facultativo Neisseria Veillonella + Pseudomonas motil Alcaligenes Halobacterium + Flavobacterium Shigella Escherichia Enterobacter Klebsiella Citrobacter Proteus Providencia Erwinia Salmonella Morganella

MSA morfología - bacilo coco Esporas Catalasa Acid Fast + Aeróbico + 6. 5% Na. Cl Staphylococcus - Clostridium + Bacillus - Streptococcus+ Enterococcus Regular Lactobacillus Listeria Corynebacterium Pleomorfo Kurthia Propionibacterium + Mycobacterium

Fermentación de carbohidratos

Bile Esculin Agar

MSA Fermentación del mannitol.

SIM Sulfide Indole Motility

Urease Recuerden traer su vaso de recolección de orina para la próxima semana!!