Laboratoire allergologie Nouvelles applications Socit Ligeoise de Dermatologie

Laboratoire & allergologie Nouvelles applications Société Liégeoise de Dermatologie Phn. Biol. E. Cavalier Phn Romy Gadisseur 17/12/2009

Ligne du temps… diagnostic de l’allergie. Caractérisation & désignation des Ig. E Tests de Provocation (SPT) 1880 Standardisation des extraits allergéniques RAST 1967 Panels d’allergènes recombinants mimant des extraits allergéniques 1 ers allergènes clonés 1988 -91 Immuno. CAP ISAC (Phadia/ VBC Genomics) Premier ”allergen microarray” 1995 -99 2000 2008 Tests IN-VIVO Tests IN-VITRO Component – Resolved -Diagnostics

Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs (I) • Hypersensibilité de type 1 (H. immédiate, allergie réaginique ou atopique) : – Immunité humorale = Allergie. Ø Médiée par les Ig. E spécifiques d’un allergène (Ig. E dépendante). Ø Tendance héréditaire. – Manifestations cliniques diverses (dermatite allergique, rhinite pollinique choc anaphylactique, asthme, rhinite, conjonctivite, urticaire, troubles digestifs, eczéma…) Ø Apparaissent en quelques minutes. – Les Ig. Es fixées sur les mastocytes tissulaires et sur les basophiles sanguins, réagissent avec l’Ag (allergène), induisant ainsi la dégranulation de ces cellules (libération d’histamine et d’autres médiateurs).

Recombinants : Production

Components - Resolved Diagnosis (CRD) « CRD » Component-Resolved Diagnosis uses defined recombinant allergens to dissect the individual patient’s Ig. E reactivity profile with the aim of identifying the disease-eliciting molecules. Valenta R et al, Clin Exp Allergy 1999 Molecules, genuine markers tell you the truth ! Mari A. , VIP Customers day, Brussels, 17 th November 2009. La présence d’Ig. E pour des composants allergéniques qui peuvent occasionner des réactions croisées peut être mesurée et permet d’estimer une sensibilisation pertinente cliniquement à d’autres sources qui contiennent des allergènes proches au niveau de la structure et au niveau de leur activité immunologique.

Ig. E « spécifiques » pour un extrait • Du point de vue du laboratoire… – Que veut dire un taux d’Ig. Es pour un extrait allergénique ? – Que faire de ce résultat ? – Qu’en est-il des soins pour le patient ? – Qu’en est-il du risque pour le patient ? • Y a-t-il un intérêt à réaliser du Component-resolved diagnosis en routine dans notre laboratoire? – Comment peut-on réaliser du CRD dans notre labo? Ø Impact sur le suivi du patient et sa santé (appréciation de la sévérité, risques, choix thérapeutiques, amélioration de la qualité de vie du patient). § Notre expérience avec la sensibilisation à l’arachide… – + Ig. Es pour f 13, anamnèse, recombinants – Question : ”Doit-on recommander une éviction stricte de l’arachide ? ”

Exemple Arachis Hypogea • Ara h 1 : Protéine de stockage (vicilline) • allergène majeur, stabilité à la digestion et chaleur. • Ara h 9 : ns. LTP • Très stable à la chaleur et à la digestion. • Réactions sévères >> réactions systémiques ! Allergénicité : • Ara h 2 : Protéine de stockage (conglutine) Ara h 2 est un allergène 100 fois plus puissant que Ara h 1 • +fréquent, potentiel de sensibilisation ++, • Ara h 8 : Profiline stabilité à la digestion ++. Koppelman SJ et al, Clin Exp Allergy 2004, 34: 583 • Réactions croisées entre de nombreux fruits • Réactions sévères >> systémiques ! et végétaux de différentes classes botaniques. Ara h 2 possède un haute stabilité protéolytique • Ara h 3 : Protéines de stockage. Lehmann (glycinine) K et al, Biochem J, 2006: 395 -463 • allergène mineur, rares sensibilisations. • CCD (MUXF 3) Après rôtissage de l’arachide, l’allergénicité d’Ara h 2 est multipliée par 3 • Ara h 8 : PR-10 (Bet v 1 homologue) Maleki SJ et al, J Allergy Clin Immunol, 2003 • Cross-reactive Carbohydrate Determinants • allergènes majeurs de l’arachide chez les patients allergiques au pollen de bouleau. • Sensible à la chaleur et à la digestion. • Rarement associés à des symptômes. • Glyco-épitopes présents dans la majorité des plantes.

Du point de vue du laboratoire : Comment contribuer à diagnostiquer une allergie à l’arachide ? Arachide (f 13) + Ara h 2 (f 423) Arachide (f 13) : Nég Arachide (f 13) : Pos Ara h 2 : Nég Ara h 2 : Pos Peu de risque de réactions sévères Risques de réaction sévère? Très haut risque de réaction sévère Comment explorer ? Recommendations Bouleau (Nord de l’Europe) : test Ara h 8 (f 352) Comment explorer? Recommendations Test : Risque • Ara h 1 (f 422) • Ara h 3 (f 424) • Ara h 9 (f 427) • Ara h 8 (f 352) • CCD (Ro 214)

Plus complexe… • Julien, B (18 ans): – Cas clinique complexe !! Ig. Es pour extraits § Atopie, Arachide, f 13 § Dermatite atopique, Soja, f 14 § Rhinite perannuelle, Crabe, f 23 § Eczema. Si nous suivons la même démarche, géant. Ail, f 47 § Allergie alimentaire (blanc d’oeuf, Blanc d’oeuf, f 75 arachide, soja, crabe et ail) grâce à tous les recombinants, – Comment expliquer les symptômes ? Pityrosporum orbiculare, m 70 § SPT Pneumallergènes: – + : D 1 et D 2, chien, graminées. – Douteux : bouleau. § SPT Trophallergènes : – + Blanc d’oeuf, arachide, soja, ail. Dermatophagoïdes pteronyssinus, d 1 on pourrait tout expliquer !! Blanc d’oeuf, f 1 9. 71 4. 43 1. 98 4. 11 0. 61 3. 93 >10 5. 37 Crevette , f 24 2. 64 Gx 3: g 1+g 5+g 6+g 12+g 13 93. 6 Bouleau, t 3 58. 0

Patient: Nom : B. Julien Adresse: Rue des bouleaux 1… Request form Immuno. CAP™Components Some other components less useful in Belgium could be available. Don’t hesitate to ask to your Lab in case of specific clinical history. June 2009 En théorie, c’est possible… En pratique, … Docteur: Nom: Cavalier Etienne Adresse : CHU de Liège Date de demande: 19/11/2009 Signature:

Immuno. CAP© ISAC • Fruit de l’association des firmes Phadia (expert des tests diagnostic in-vitro) et VBC Génomics (expert en microarrays) : L’ « Immuno. CAP ISAC » . Ø Alliance de la recherche dans le domaine de l’allergologie moléculaire et de l’innovante technologie des biochips. – Harwanegg C et al, Expert Rev Mol Diagn 2004 • Multiplex moderne utilisé comme outil supplémentaire pour le diagnostic in-vitro, par les allergologue et spécialistes, basé exclusivement sur les composants allergéniques. – – Plateforme miniaturisée d’immunoessais pour la mesure des Ig. Es dirigés contre >40 sources allergéniques communes, en un seul dosage. Biopuce composée de 103 allergènes natifs et recombinants immobilisés sur une support solide. § Allergènes choisis en fonction de leur pertinence dans l’établissement d’un profil de sensibilisation. Tests sur 20 μL de sérum ou sang total. Permet de réaliser du CRD rapidement et à moindre coût.

Triplet d’allergènes après réaction fluorescente Molécule allergénique Immuno Solid-phase Allergen. Chip Anticorps secondaire (ISAC)anti Ig. E humain couplé à une molécule de fluorescence Immuno. CAP ISAC version 103 Anticorps Ig. E (dans le sérum du patient) sera remplacé en juin 2010 par Immuno. CAP ISAC 4 sites de réaction version 125 (> 20 allergènes différents ajoutés)

B. Julien (18 ans) Bet v 1 homologues (PR-10): Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1, Mal d 1, Pru p 1, Gly m 4, Ara h 8, Api g 1 Marqueurs d’espèce : Gal d 1, Bos d lactoferrine, Fel d 1, Fel d 4, Can f 1, Mus m 1, Alt a 1 Profilines : Pollens : Cyn d 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6 et Ole e 1 Bet v 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 1, Phl p 12 Der p 1, Der f 2, Der p 2, Eur m 2 Grâce au CRD, nous trouvons des explications : Nombreuses allergies alimentaires dues à la sensibilisation aux profilines, protéines PR-10 (OAS), tropomyosine (fruit de mer), lait de vache… Nombreuses graminées, acariens, animaux domestiques… qui expliquent la rhinite perannuelle exacerbée durant le période pollinique. Tropomyosine : Der p 10

Autres nouveaux tests en allergologie – Lorsque le diagnostic in-vitro est indisponible via les moyens usuels (dosage d’Ig. Es) : § Médicaments (AB, AINS, curarisants, …), § Additifs alimentaires, § Colorants, § Conservateurs, § Excipients. – Dans le cas de discordances entre anamnèse clinique et résultats biologiques. – Lorsque les résultats des tests in-vivo sont ininterprétables, ou irréalisables : § Enfants § Si risque ++ § En cas de refus du patient de prendre un risque… Ø Pensez aux tests de provocations in-vitro : § CAST (Cellular Antigen Stimulation Test) § BAT (Basophil Activation Test)

CAST / BAT • Nouvelles approches scientifiquement séduisantes qui permettent d’explorer le mécanisme physiopathologique des réactions allergiques et d'intolérance et ce, au niveau cellulaire. • Sans danger pour le patient, ces tests de provocation in-vitro permettent d'explorer les réactions allergiques Ig. E-dépendantes. • Le concept de ces tests est de mimer in-vitro le contact entre l’allergène et les cellules qui vont générer les symptômes. • Il permettent non seulement d'objectiver mais aussi de quantifier la réactivité des leucocytes par : – – • Dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique (CAST). Évaluation du pourcentage des basophiles activés via l’expression du marqueur CD 63 de la membrane des basophiles activés (BAT). Techniques robustes sur lesquelles on peut compter pour le diagnostic in-vitro des allergies immédiates et ce, en complément d’autres tests in-vitro déjà existants. – Intérêt dans la clinique en routine. – Mais : Nécessité d’une standardisation (seuil de décision clinique, dilutions des allergènes) § Chaque allergène doit être étudié et testé un par un afin de déterminer la concentration optimale

A. Cellular Antigen Stimulation Test - CAST • Test de provocation in-vitro. • S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes) endéans les 4 h. • Test ELISA (immuno-essai). • Il permet d'objectiver et de quantifier la réactivité des leucocytes par dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique. – • Les leucotriènes (LT) sont des médiateurs puissants de la réaction allergique et participent à la genèse des manifestations cliniques de type asthme, rhinoconjonctivite, urticaire, oedème angiomateux et choc anaphylactique. Intérêt dans le diagnostic des allergies : – Alimentaires – Au latex – Aux venins d’insectes » MAIS SURTOUT : – Aux médicaments § Antibiotiques, aspirine, AINS.

B. Basophil Activation Test - BAT • La cytométrie de flux est un outil intéressant pour l’analyse des différents types de cellules et permet d’identifier des populations cellulaires spécifiques, même dans le cas des populations présentes en petit nombre. – • La technique semble idéale pour étudier la dégranulation des basophiles induite par l’allergène. L’identification des cellules est basée initialement sur l’expression du CD 45 (antigène présent à la surface de leucocytes) et sur la présence d’Ig. E à la surface cellulaire. – Les basophiles expriment le récepteur de haute affinité pour les Ig. E (FcεRI). • Dans cette population définie, l’activation des cellules après avoir été mises en contact avec l’allergène est déterminée par l’expression du marqueur CD 63 de la membrane. – • CD 63 est ancré dans la membrane des granules du basophile (contenant l’histamine) et son expression sur la partie externe de la cellule reflète la dégranulation cellulaire et la fusion des granules et la membrane plasmatique. L’expression du CD 63 a été proposé comme un excellent moyen de monitorer l’activation des basophiles. Boumiza R , Clinical and Molecular Allergy 2005, 3: 9

Basophil Activation Test - BAT • Intérêt dans le diagnostic des allergies : – Alimentaires (blanc d’œuf, arachide…) – Au latex – Aux venins d’insectes – Aux médicaments § Curarisants, antibiotiques, AINS, – Pour les curarisants les résultats en BAT sont parfaitement comparables au CAST… Donc le CAST (moins onéreux) est recommandé… • Sensibilité comparable aux Ig. Es. • S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes) endéans les 4 h. • Permet de suivre l’efficacité de l’Immunothérapie spécifique. – Cette technologie a plus de potentiel que d’embûches et les résultats fournis par cette technique sont utiles dans plusieurs situations malgré le fait que chaque laboratoire ait son propre protocole. – – D. Ebo, Clinical & Experimental Allergy, 39 : 1115– 1116 María L. Sanz et al, Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, pp 391– 402

Immuno. CAP Tryptase • • • La Tryptase est la protéine la plus abondante des mastocytes. La Pro-β-tryptase est sécrétée de manière constitutive tandis que la β-tryptase mature reflète l’activation des mastocytes. – Le taux basal de protryptase donne une idée du nombre de mastocytes. – Un taux élevé de β-tryptase mature indique une activation des mastocytes. Immuno. CAP Tryptase permet de mesurer la tryptase totale (α-tryptase + β-tryptase) Un taux de tryptase sérique (pro-β + pro-α + β-tryptase mature) élevé indique une dégranulation des mastocytes, comme dans les réactions anaphylactiques. Utilité clinique : – Anaphylaxie § Taux élevé transitoire – confirme l’activation des mastocytes – utile pour un diagnostic post mortem – Marqueur de risque de réaction sévère § Un taux basal élevé indique une augmentation du risque de réaction sévère – dans l’allergie aux venins et médicamenteuse – Avant et pendant l’IT pour venins (Immuno. Thérapie spécifique)

Immuno. CAP Tryptase • Timing pour la collecte d’échantillons : – – – 1 er échantillon : dans l’intervalle 15 min-3 h après l’apparition des symptômes. 2 nd échantillon : après 24 -48 h, afin de confirmer le retour au taux basal. 3ème échantillon : après 1 -2 semaines si suspicion de mastocytose

Western Blot • Pour certains cas complexes d’allergie, • Lorsque le CRD et les Ig. Es pour les allergènes recombinants existants sur le marché ne permettent pas d’expliquer une réactivité aux Prick tests ou un dosage d’Ig. Es positif pour un extrait allergénique, • Lorsqu’il y a néanmoins une histoire clinique pertinente… • Il est possible de tenter la mise en évidence de la protéine responsable par réalisation d’un Western Blot…

En résumé • La route de la découverte des profils de sensibilisation est tracée… – Les extraits allergéniques sont utiles : § § § En première intention, Ne permet pas de conclure dans tous les cas (multiple positivités des tests, manque de précision), Ig. Es pour les extraits pas toujours significatifs. Échecs de désensibilisation Ne permettent pas d’évaluer la sévérité des réactions allergiques Contribuent parfois à des régimes d’éviction trop larges… – Le CRD est entre nos mains. § Sensibilisations peuvent causer des erreurs de diagnostic (et erreurs thérapeutiques également). § Familles de protéines décrites, similarités de structure (homologie de chaînes d’acides-aminés ou homologie de structure) § Allergie à une seule protéine peut causer des réactions croisées à d’autres protéines de la même famille. § Allergènes recombinants permettent de se focaliser sur un (ou plusieurs) allergène(s) d’une source : – Disponibilité en CAP (et/ou en ISAC) ou en cours de développement…

En résumé • Les microarrays peuvent nous être profitables, dans des cas difficiles : – 103 recombinants or allergènes naturels purifiés en une seule détermination… § Validation analytique de l’Immuno. CAP© ISAC : – Concordance : 86% (résultats négatifs) et 94% (résultats positifs) § L’Immuno. CAP© ISAC a un rôle à jouer dans le diagnostic et le soin aux patients avec des profils de sensibilisation complexes. § Comme cette technique génère potentiellement des résultats inattendus, la réalisation et l’interprétation d’un microarray doivent être évalués en parallèle avec la clinique du patient. • Interprétation des résultats difficile : – Destiné aux spécialistes ! – Nous sommes là pour vous aider…

En résumé • L’Immuno. CAP ISAC est un outil de choix pour évaluer le profil de sensibilisation d’un patient : – Polysensibilisé, atopique – Dont l’anamnèse n’est pas très claire – Dont les prick tests donnent beaucoup de positivités. • L’Immuno. CAP ISAC permet de travailler sur une quantité MINIME de sérum (20µL) et de gagner du temps (et finalement de l’argent). • La technique permet d’éviter les régimes d’éviction trop larges et d’améliorer le confort de vie du patient allergique/atopique… • Intérêt en pédiatrie…

En résumé • Les tests de BAT et de CAST ne sont pas à utiliser en première intention. – Ils sont complémentaires aux tests cutanés et Ig. Es. – Intérêt particulier quand ces tests ne peuvent être réalisés ou aboutissent à des résultats douteux en comparaison avec l’anamnèse clinique. • Le dosage de tryptase – Un taux basal élevé indique une augmentation du risque de réaction sévère § dans l’allergie aux venins et médicamenteuse § Avant et pendant l’IT pour venins (Immuno. Thérapie spécifique) • Les Western Blot peuvent apporter une aide au diagnostic mais nécessite encore un travail important de la part du laboratoire…

Merci pour votre attention !!