Laboratoire allergologie Nouvelles applications Colloque de Pneumologie Phn

Laboratoire & allergologie Nouvelles applications Colloque de Pneumologie Phn. Biol. E. Cavalier Phn Romy Gadisseur 07/01/2010

Épidémiologie de l’allergie • Allergie=4ème maladie chronique (OMS). • Asthme allergique = 1ère maladie chronique chez l’enfant. • +/- 30% allergiques. • Coût pour la société +++. • Allergies x 2 ces 15 dernières années dans les pays développés !! La raison ? Train de vie occidentalisé. – Meilleure hygiène de vie § ↓ infections => Réponse immunitaire modifiée et dirigée vers les allergènes de l’environnement : Développement d’allergies. § ↑ utilisation d’antibiotiques. – Modification du régime alimentaire. – Vie sédentaire (hygrométrie ++ & température ++) & Exposition aux allergènes domestiques >> exposition à de nouveaux allergènes (confinement, air conditionné, animaux domestiques…). – Tabagisme passif de l’enfant (favorise la synthèse d’Ig. E). – Pollution atmosphérique +++. – Nouveaux allergènes (latex)

Allergie : Définition… “ Allergie ” Maladie due à une réponse inadaptée et excessive de notre organisme vis à vis de l’environnement : des substances étrangères et normalement inoffensives entraînent une réaction de défense de notre système immunitaire, nuisible à l’organisme. Allos = différent Ergon = agir.

Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs (I) • Hypersensibilité de type 1 (H. immédiate, allergie réaginique ou atopique) : – Immunité humorale = Allergie. Ø Médiée par les Ig. E spécifiques d’un allergène (Ig. E dépendante). Ø Tendance héréditaire. – Manifestations cliniques diverses (dermatite, conjonctivite, asthme, rhinite pollinique, troubles digestifs, urticaire, choc anaphylactique). Ø Apparaissent en quelques minutes. – Les Ig. Es fixées sur les mastocytes tissulaires et sur les basophiles sanguins, réagissent avec l’Ag (allergène), induisant ainsi la dégranulation de ces cellules (libération d’histamine et d’autres médiateurs).

Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs

Ligne du temps… diagnostic de l’allergie. Caractérisation & désignation des Ig. E Tests de Provocation (SPT) 1880 Standardisation des extraits allergéniques RAST 1967 Panels d’allergènes recombinants mimant des extraits allergéniques 1 ers allergènes clonés 1988 -91 Immuno. CAP ISAC (Phadia/ VBC Genomics) Premier ”allergen microarray” 1995 -99 2000 2008 Tests IN-VIVO Tests IN-VITRO Component – Resolved -Diagnostics

Recombinants : Production

Components - Resolved Diagnosis (CRD) « CRD » Component-Resolved Diagnosis uses defined recombinant allergens to dissect the individual patient’s Ig. E reactivity profile with the aim of identifying the disease-eliciting molecules. Valenta R et al, Clin Exp Allergy 1999 Molecules, genuine markers tell you the truth ! Mari A. , VIP Customers day, Brussels, 17 th November 2009. De nombreuses sources allergéniques contiennent des allergènes proches au niveau de leur structure et au niveau de leur activité immunologique. CRD = Déterminer la présence d’Ig. E pour des composants allergéniques responsables de réactions croisées afin de comprendre une sensibilisation et d’évaluer la sévérité des symptômes.

Allergènes, Bases de données Allergènes de l’ arachide Propriété biochimique de l’allergène

Ig. E « spécifiques » pour un extrait • Du point de vue du laboratoire… – – Que veut dire un taux d’Ig. Es pour un extrait allergénique ? Que faire de ce résultat ? Qu’en est-il des soins pour le patient ? Qu’en est-il du risque pour le patient ? Ø Impact sur le suivi du patient et sa santé (appréciation de la sévérité, risques, choix thérapeutiques, amélioration de la qualité de vie du patient). • Y a-t-il un intérêt à réaliser du Component-resolved diagnosis en routine dans… § notre laboratoire ? § en pneumologie(-allergologie)? – – – Pollution, allergènes domestiques & allergies, Asthme et/ou rhinite allergique et allergies alimentaires, Asthme du boulanger, expositionnel Rhinites allergiques & désensibilisations, …

Cas Clinique (I) 1. Julie, F (29 ans): § § f 13 (arachide) = 27. 4 k. UA/L. SPT + : arachide, noix, noisette, graine de sésame, graminées, bouleau, pignon. SPT - : soja, oeuf et noix. Asthme, troubles gastrointestinaux et érythème après ingestion de noix.

Cas Clinique (II) 2. Laurent, H (24 ans): § § § f 13 (arachide) = 1. 22 k. UA/L. Ig. Es + : bouleau, pomme, poire, pêche, abricot, noisette, noix et récemment céleri et fenouil. Atopie, polysensibilisé, oral allergy syndrome (OAS) et évolution récente vers des difficultés respiratoires. 3. Maud, F (15 ans): § § f 13 (arachide) = 1. 23 k. UA/L Ig. Es + : pollens de graminées, lait de vache, carotte, orange, tomate, froment, pomme de terre, oignon, ail, céleri, banane, pêche et arachide. Sensibilisation à différentes variétés de plantes Troubles gastro-intestinaux.

Cas Clinique (III) 4. Eddy, M (43 ans) : § § § f 13 (arachide) = 0, 44 k. UA/L SPT+ : bouleau, pomme, pêche, banane, ail, arachide. Gonflement des lèvres. § Sensibilisation au bouleau… Que pouvons-nous conclure?

Cas Clinique (IV) 5. Nadia, F (24 ans) : § § Pour ces 5 cas cliniques… f 13 (arachide) = 1, 73 k. UA/L f 17 (noisette) = 4, 23 k. UA/L Les taux d’Ig. Es pour l’extrait d’arachide sont-ils proportionnels § Ig. Es + : pomme, pêche, noisette, arachide à la sévérité de l’allergie ? § SPT +++ : arachide, noix, noisette. . § Atopie, polyallergie, rhinoconjonctivite, OAS, urticaire et angiœdème Qu’en est-il du risque? Régime d’éviction ou non ? Quel suivi pour le patient? Évolution du patient ? ?

Prédire les réactions croisées • Proteines de stockage – Présente dans les graines, ressource matérielle lors de la croissance de la plante. – Parfois, stable et résistante à la chaleur causant des réactions aux aliments cuits. r. Ses i 3 Cor a 9 r. Ber e 1 Ara h 2 Ara h 3 n. Gly mβ-conglycinin n. Gly m glycinin

Prédire les réactions croisées • Protéines PR-10, Bet v 1 homologue – Instable à la chaleur, aliment cuit toléré en général. » Breiteneder H, Biotechnol Adv, 2005 – Associé à des symptômes locaux comme l’Oral Allergy Syndrome (OAS). – Associé aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Nord de l’Europe. Cor a 1. 01 Cor a 1. 04 Gly m 4 Ara h 8 Api g 1 Dau c 1 Bet v 1 Pru p 1 Mal d 1 Pyr c 1 Pru ar 1 Pru av 1

Oral Allergy Syndrome (OAS) • Syndrome d’Allergie Orale : Réaction allergique, gêne au niveau de la bouche qui apparaît instantanément ou peu de temps après l’ingestion de l’aliment. – • Un chatouillement ou sensation de brûlure au niveau des lèvres, de la bouche et/ou du pharynx. Associé à la sensibilisation à une ou plusieurs protéine de type PR-10 càd homologue de Bet v 1 (bouleau). o o o o Noisette, 46% Pomme, 39% Pêche, 24% Cerise, 22% Noix, 21% Poire, 20% Amande, 19% Prune, 17% o o o o Noix du Brésil, 16% Pomme de terre, 15% PR-10 Carotte, 13% r. Bet v 1 Arachide, 10% r. Pru p 1 Fraise, 10% r. Gly m 4 r. Ara h 8 Orange, 9% r. Api g 1. 01 r. Aln g 1 Abricot, 7% r. Cor a 1 n. Act d 8 r. Mal d 1 r. Dau c 1

Prédire les réactions croisées • LTP (non-specific Lipid Transfer Protein, ns. LTP) – Protéines stables à la chaleur et à la digestion, causent donc aussi des allergies aux aliments cuits. – Souvent associées à des réactions systémiques, réactions plus sévères qui suivent l’OAS. – Les LTPs causent souvent des allergies alimentaires aux fruits en l’absence d’allergie pollinique. – Souvent, associées aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Sud de l’Europe. LTP Zea m 14 Cor a 8 Pru p 3 Pru av 3 Mal d 3 Pru ar 3 Ara h 9 n. Pru p 3 r. Cor a 8 r. Par j 2 n. Art v 3 Ara h 9 Mal d 3 Zea m 4 Jug r 3

Prédire les réactions croisées • Profiline – Rarement associée à des symptômes cliniques mais réactions sévères pour une minorité de cas. – Les profilines sont présentes dans une large variété de pollens (d’arbres, d’herbacées et de graminées) et d’aliments d’origine végétales. – Il y a une grande homologie de structure entre les profilines différents fruits et légumes. Ara h 5 r. Mer a 1 r. Phl p 12 r. Hev b 8 r. Mal d 4 Pru p 4 r. Cor a 2 r. Ole e 2 r. Bet v 2 PFL r. Phl p 12 r. Bet v 2 n. Ole e 2 r. Mer a 1 r. Hev b 8 r. Mal d 4 r. Pru p 4 n. Act d 9 n. Ana c 1 n. Ara h 5 r. Pyr c 4

En résumé… Symptômes caractéristiques Local (OAS) Systémique Profil de sensibilisation protéines PR-10 ns. LTP Profilines

Réactions croisées in-vitro • CCD (MUXF 3) : – Marqueur de sensibilisation aux déterminants carbohydrates (crossreacting carbohydrate determinants). Glyco-épitopes. – Présents dans la majorité des plantes, – Il s’agit d’Ig. Es dirigés contre les glycans : causent des profils de sensibilisations croisées larges parmi les extraits allergéniques (parfois responsables de réactions croisées in-vitro). § effets « in-vivo » ? – Rarement associé à des symptômes cliniques… » Mais, publications ? » A confronter aux informations cliniques et aux SPT… – Tester si… § Sensibilisation aux fruits et légumes, graînes. § Sensibilisation au latex chez un patient pollinique sans exposition occupationnelle. § Sensibilisation au venin d’Hyménoptère avec/sans sensibilisation aux pollens.

Arachis Hypogea • Ara h 1 : Protéine de stockage (vicilline) • Ara h 9 : ns. LTP • Stable à la chaleur et à la digestion. • allergène majeur • Ara h 2 : Protéine de stockage (conglutine) • Réactions sévères >> réactions systémiques ! • + fréquent, sensitizing potential ++, • Ara h 8 : Profiline stability ++ to digestion. Allergenicity : • Réactions croisées entre de nombreux fruits et légumes. Ara h 2 est un allergène 100 fois plus puissant que Ara h 1 • allergène mineur, rares sensibilisations. • Ara h 3 : Protéines de stockage (glycinine) • Ara h 8 : PR-10 Koppelman SJ et al, Clin Exp Allergy 2004, 34: 583 • CCD (MUXF 3) Ara h 2 possède un haute stabilité protéolytique • allergènes majeurs de l’arachidechez les Lehmann K et al, Biochem • J, Cross-reactive Carbohydrate Determinants 2006: 395 -463 patients allergiques au pollen de bouleau. • Rarement associés à des symptômes. Après rôtissage de l’arachide, l’allergénicité d’Ara h 2 est multipliée par 3 • Sensible à la chaleur et à la digestion. Maleki SJ et al, J Allergy Clin Immunol, 2003 • Présent dans la majorité des plantes.

Du point de vue du laboratoire : Comment contribuer à diagnostiquer une allergie à l’arachide ? Arachide (f 13) + Ara h 2 (f 423) Arachide (f 13) : Nég Arachide (f 13) : Pos Ara h 2 : Nég Ara h 2 : Pos Peu de risque de réactions sévères Risques de réaction sévère? Très haut risque de réaction sévère Comment explorer ? Recommendations Bouleau (Nord de l’Europe) : test Ara h 8 (f 352) Comment explorer? Recommendations Test : Risque • Ara h 1 (f 422) • Ara h 3 (f 424) • Ara h 9 (f 427) • Ara h 8 (f 352) • CCD (Ro 214)

Cas clinique (1) 1. Julie, F (29 ans): § f 13 (peanut) = 27. 4 k. UA/L. – SPT + : arachide, noix, noisette, graîne de sésame, bouleau, graminées, pignon de pin. – SPT - : soja, blanc d’oeuf, noix. § Asthme, intolérance gastrointestinale et érythème après ingestion de noix. § Quels sont les risques ? Bouleau?

Cas clinique (1) Arachide (f 13) = 27, 4 k. UA/L Ara h 2 (f 423) = 14, 2 k. UA/L Arachide (f 13) : Pos Ara h 2 : Pos Très haut risque de réaction sévère Comment explorer? Recommendations Tests : Risques • Ara h 1 = 3, 46 k. UA/L • Ara h 3 = 0, 6 UA/L • Ara h 9 <0, 1 k. UA/L • Ara h 8 = 2, 27 k. UA/L • CCD < 0, 1 k. UA/L • Sensibilisation à Ara h 8 due à une allergie au bouleau (PR-10). Réactions croisées : protéines de stockage ? ? • Sensibilisation à 3 allergènes majeurs d’arachide. Allergènes majeurs de l’arachide Protéines de stockage • Sensibilisation à Ara h 2 : Protéine de stockage (conglutine), Stable ++ à la digestion, régime d’éviction d’arachide car risque de réaction sévère ++. protéine PR-10 de l’arachide !

Cas clinique (2) 2. Laurent, H (24 ans) : § f 13 (arachide) = 1. 22 k. UA/L. – Ig. Es + : bouleau, pomme, poire, noix, noisette, abricot, et récemment céleri et fenouil. § Atopie, polysensibilisé, oral allergy syndrome(OAS) et récemment évolution vers des difficultés respiratoires. § Quels sont les risques? – – Qu’en est-il de la sensibilisation au Bouleau ? Et l ’évolution récente de l’allergie ?

Cas clinique (2) Arachide (f 13) = 1, 22 k. UA/L Ara h 2 (f 423) < 0, 10 k. UA/L • Sensibilisation à l’arachide après allergie au bouleau (PR-10 proteins). • Sensibilisation aux autres PR-10 : - Pomme (Mal d 1), poire (Pyr c 1), pêche (Pru p 1), abricot (Pru ar 1), noisette (Cor a 1) et récemment le céleri (Api g 1) • Dans ce cas, évolution de l’OAS avec détresse respiratoire expliquée par une sensibilisation récente à Api g 1. Arachide (f 13) : Pos Ara h 2 : Nég Risques de réaction sévère ? Comment explorer ? Recommendations Tests : Risque • Ara h 1 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 3 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 9 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 8 = 8, 4 k. UA/L • CCD < 0, 1 k. UA/L PR-10, Bet v 1 -homologue

Cas clinique (3) 3. Maud, F (15 ans): § f 13 (arachide) = 1. 23 k. UA/L – Ig. Es + : pollens de graminées, lait de vache, carotte, orange, tomate, froment, pomme de terre, ail, oignon, céleri, banane, pêche et arachide. § Sensibilisation à une large variété d’aliments issus du règne végétal. § Troubles gastro-intestinaux. § Quels sont les risques ? – Sensibilisations multiples aux fruits et légumes.

Cas cliniques (3) Arachide (f 13) = 1, 23 k. UA/L Ara h 2 (f 423) < 0, 1 k. UA/L • Sensibilisation aux CCD : - Marqueurs de sensibilisation aux Déterminants Carbohydrates. - Multiple réactions croisées. - Rarement associé à des symptômes cliniques. • Tester les CCD si sensibilisations aux fruits et légumes, graînes. Arachide (f 13) : Pos Ara h 2 : Nég Risques de réaction sévère? Comment explorer ? Recommendations Tests : Risques • Ara h 1 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 3 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 9 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 8 < 0, 1 k. UA/L • CCD = 1, 93 k. UA/L CCD

Cas clinique (4) 4. Eddy, M (43 ans) : § f 13 (arachide) = 0, 44 k. UA/L – SPT+ : bouleau, pomme, pêche, banane, ail et arachide. § Gonflement des lèvres § Quels sont les risques ? – Sensibilisation au bouleau…

Cas clinique (4) Arachide (f 13) = 0, 44 k. UA/L Ara h 2 (f 423) < 0, 1 k. UA/L • Sensibilisation aux profilines (Bet v 2) • Rarement associées à des symptômes cliniques sauf des OAS. De très rares réactions sévères dans une minorité de patients. • Présence de profilines dans de nombreux fruits et légumes. - Bouleau (Bet v 2), pomme (Mal d 4), pêche (Pru p 4), banane (Mus a 1), ail (All c 4), arachide (Ara h 5). Arachide(f 13) : Pos Ara h 2 : Nég Risque de réaction sévère? Comment explorer ? Recommendations Testés • Ara h 1 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 3 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 9 < 0, 1 k. UA/L • Ara h 8 < 0, 1 k. UA/L • CCD < 0, 1 k. UA/L ? Bet v 2 = 4, 6 k. UA/L

Cas clinique (5) 5. Nadia, F (24 ans): § f 13 (arachide) = 1, 73 k. UA/L § f 17 (noisette) = 4, 23 k. UA/L – – Ig. Es + : pomme, pêche, noisette et arachide SPT +++ : arachide, noix et noisette. § Atopie, polyallergie, rhinoconjonctivite, OAS, urticaire et angiœdème § Quels sont les risques ? …angioedème…

Cas clinique (5) Arachide (f 13) = 1, 23 k. UA/L Ara h 2 (f 423) <0, 1 k. UA/L Arachide (f 13) : Pos Ara h 2 : Nég Risque de réaction sévère? Comment explorer? Recommendations Test : Risques • Ara h <0, 1 k. UA/L • Ara h 3 <0, 1 k. UA/L • Ara h 9 = 8, 2 k. UA/L • Ara h 8 <0, 1 k. UA/L • CCD <0, 1 k. UA/L Noisette (f 17) = 4, 23 k. UA/L Cor a 8 (f 425) = 3, 87 k. UA/L Noisette (f 17) : Pos Cor a 8 : Pos ns. LTP Très haut risque de réaction sévère • Sensibilisation aux ns. LTP : - Marqueur de réaction croisée. - Associé à des réactions sévères. - Principalement dans le sud de l’Europe. - Sensibilisation à la pomme (Mal d 3), pêche (Pru ns. LTP p 3), noisette (Cor a 8) et arachide (Ara h 9).

Plus complexe… • Julien, B (18 ans): Ig. Es pour extraits – Cas clinique complexe !! Arachide, f 13 § Atopie, Soja, f 14 § Dermatite atopique, Crabe, f 23 § Rhinite perannuelle, Ail, f 47 Si nous suivons la même démarche, § Eczema géant. Blanc d’oeuf, f 75 § Allergie alimentaire (blanc d’oeuf, Pityrosporum orbiculare, m 70 grâce à tous les recombinants, arachide, soja, crabe et ail) Dermatophagoïdes pteronyssinus, d 1 – Comment expliquer les symptômes ? Blanc d’oeuf, f 1 on pourrait tout expliquer !! § SPT Pneumallergènes: Crevette , f 24 – + : D 1 et D 2, chien, graminées. Gx 3: g 1+g 5+g 6+g 12+g 13 – Douteux : bouleau. Bouleau, t 3 § SPT Trophallergènes : – + Blanc d’oeuf, arachide, soja, ail. 9. 71 4. 43 1. 98 4. 11 0. 61 3. 93 >10 5. 37 2. 64 93. 6 58. 0

Patient: Nom : B. Julien Adresse: Rue des bouleaux 1… Request form Immuno. CAP™Components Some other components less useful in Belgium could be available. Don’t hesitate to ask to your Lab in case of specific clinical history. June 2009 En théorie, c’est possible… En pratique, … Docteur: Nom: Cavalier Etienne Adresse : CHU de Liège Date de demande: 19/11/2009 Signature:

Immuno. CAP© ISAC • Fruit de l’association des firmes Phadia (expert des tests diagnostic in-vitro) et VBC Génomics (expert en microarrays) : L’ « Immuno. CAP ISAC » . Ø Alliance de la recherche dans le domaine de l’allergologie moléculaire et de l’innovante technologie des biochips. – Harwanegg C et al, Expert Rev Mol Diagn 2004 • Multiplex moderne utilisé comme outil supplémentaire pour le diagnostic in-vitro, par les allergologue et spécialistes, basé exclusivement sur les composants allergéniques. – – Plateforme miniaturisée d’immunoessais pour la mesure des Ig. Es dirigés contre >40 sources allergéniques communes, en un seul dosage. Biopuce composée de 103 allergènes natifs et recombinants immobilisés sur une support solide. § Allergènes choisis en fonction de leur pertinence dans l’établissement d’un profil de sensibilisation. Tests sur 20 μL de sérum ou sang total. Permet de réaliser du CRD rapidement et à moindre coût.

Triplet d’allergènes après réaction fluorescente Molécule allergénique Immuno Solid-phase Allergen. Chip Anticorps secondaire (ISAC)anti Ig. E humain couplé à une molécule de fluorescence Anticorps Ig. E (dans le sérum du patient) 4 sites de réaction

Immuno. CAP® ISAC : Version 103. Protéines, Réactions croisées : – 11 PR-10 : – 2 Parvalbumines : Immuno. CAP ISAC § Important ! (protéines Bet v 1 -like) : version 103 § Bien representée, interêt ++ – 4 ns. LTP : § Lesquelles sont les plus représentatives? – 4 Tropomyosines : § En rajouter ? sera remplacé en juin 2010 par § Important ! – Lesquelles? – 5 Profilines : – 5 albumines sériques : § Tant de profilines existent… § Lesquelles sont les plus représentatives? représentatives des version 125 différentes – Venin de guêpe et d’abeille : familles botaniques ? (> 20 allergènes différents ajoutés) § Ajout prévu prochaine version – 5 Protéines de stockage Immuno. CAP ISAC

Immuno Solid-phase Allergen Chip (ISAC)

B. Julien (18 ans) Bet v 1 homologues (PR-10): Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1, Mal d 1, Pru p 1, Gly m 4, Ara h 8, Api g 1 Marqueurs d’espèce : Gal d 1, Bos d lactoferrine, Fel d 1, Fel d 4, Can f 1, Mus m 1, Alt a 1 Profilines : Pollens : Cyn d 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6 et Ole e 1 Bet v 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 1, Phl p 12 Der p 1, Der f 2, Der p 2, Eur m 2 Grâce au CRD, nous trouvons des explications : Nombreuses allergies alimentaires dues à la sensibilisation aux profilines, protéines PR-10 (OAS), tropomyosine (fruit de mer), lait de vache… Nombreuses graminées, acariens, animaux domestiques… qui expliquent la rhinite perannuelle exacerbée durant le période pollinique. Tropomyosine : Der p 10

Autres nouveaux tests en allergologie • Les principaux allergènes impliqués dans l’allergie immédiate sont l’arachide, le poisson, les venins de guêpe et d’abeille, le latex et les médicaments. • Le diagnostic est en général basé sur une histoire clinique évocatrice (incluant une association temporelle entre l’exposition à l’allergène et l’apparition des symptômes), des prick tests positifs (Gold Standard dans ce contexte) et, si disponible, le dosage d’Ig. Es. • Lorsque le diagnostic in-vitro est indisponible via les moyens usuels (dosage d’Ig. Es) : – Dans le cas des médicaments (AB, AINS, curarisants, …), additifs alimentaires, colorants, conservateurs, excipients. • Dans le cas de discordances entre anamnèse clinique et résultats biologiques. • Lorsque les résultats des tests in-vivo sont ininterprétables, ou irréalisables : – Enfants – Si risque ++ – En cas de refus du patient de prendre un risque… • Pensez aux tests de provocations in-vitro : – CAST (Cellular Antigen Stimulation Test) – BAT (Basophil Activation Test)

Nouveaux tests en allergologie • Ces tests offrent une nouvelle approche scientifiquement séduisante des réactions allergiques et d'intolérance en explorant leur mécanisme physiopathologique au niveau cellulaire. • Le concept de ces tests est de mimer in-vitro le contact entre l’allergène et les cellules qui vont générer les symptômes. • Sans danger pour le patient, ces tests de provocation in-vitro permettent d'explorer les réactions allergiques Ig. E-dépendantes. • Il permettent non seulement d'objectiver mais aussi de quantifier la réactivité des leucocytes par : – – • dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique (CAST). Évaluation du pourcentage des basophiles activés via l’expression du marqueur CD 63 de la membrane des basophiles activés (BAT). Techniques robustes et sur lesquelles on peut compter pour le diagnostic in-vitro des allergies immédiates et ce, en complément d’autres tests in-vitro déjà existants. – Intérêt dans la clinique en routine. – Mais : Nécessité d’une standardisation (seuil de décision clinique, dilutions des allergènes) § Chaque allergène doit être étudié et testé un par un afin de déterminer la concentration optimale

A. Cellular Antigen Stimulation Test - CAST • Test de provocation in-vitro. • S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes). • Test ELISA (immunoessai) • Il permettent d'objectiver et de quantifier la réactivité des leucocytes par dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique. – Les leucotriènes (LT) sont des médiateurs puissants de la réaction allergique et participent à la genèse des manifestations cliniques de type asthme, rhinoconjonctivite, urticaire, oedème angiomateux et choc anaphylactique. • Grand intérêt dans le cadre des allergies médicamenteuses (AINS, Aspirine…), ou aux colorants, excipients… et pour les allergies aux venins.

B. Basophil Activation Test - BAT • La cytométrie de flux est un outil intéressant pour l’analyse des différents types de cellules et permet d’identifier des populations cellulaires spécifiques, même dans le cas des populations présentes en petit nombre. – • La technique semble idéale pour étudier la dégranulation des basophiles induite par l’allergène. L’identification des cellules est basée initialement sur l’expression du CD 45 (antigène présent à la surface de leucocytes) et sur la présence d’Ig. E à la surface cellulaire. – Les basophiles expriment le récepteur de haute affinité pour les Ig. E (FcεRI). • Dans cette population définie, l’activation des cellules après avoir été mises en contact avec l’allergène est déterminée par l’expression du marqueur CD 63 de la membrane. – • CD 63 est ancré dans la membrane des granules du basophile (contenant l’histamine) et son expression sur la partie externe de la cellule reflète la dégranulation cellulaire et la fusion des granules et la membrane plasmatique. L’expression du CD 63 a été proposé comme un excellent moyen de monitorer l’activation des basophiles. Boumiza R , Clinical and Molecular Allergy 2005, 3: 9

Basophil Activation Test - BAT • Diagnostic : – Allergies alimentaires – Latex – Venins – Médicaments § Curarisants, antibiotiques, AINS • Sensibilité comparable aux Ig. Es. • S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes). • Permet de comparer des extraits allergéniques et des allergènes recombinants (Immunothérapie spécifique). • Suivre l’efficacité de l’Immunothérapie spécifique. – Cette technologie a plus de potentiel que d’embûches et les résultats fournis par cette technique sont utiles dans plusieurs situations malgré le fait que chaque laboratoire ait son propre protocole. – D. Ebo, Clinical & Experimental Allergy, 39 : 1115– 1116 – María L. Sanz et al, Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, pp 391– 402

En résumé • La route de la découverte des profils de sensibilisation est tracée… – Les extraits allergéniques sont utiles : § § § En première intention, Ne permet pas de conclure dans tous les cas (multiple positivités des tests, manque de précision), Ig. Es pour les extraits pas toujours significatifs. Échecs de désensibilisation Ne permettent pas d’évaluer la sévérité des réactions allergiques Contribuent parfois à des régimes d’éviction trop larges… – Le CRD est entre nos mains. § Sensibilisations peuvent causer des erreurs de diagnostic (et erreurs thérapeutiques également). § Familles de protéines décrites, similarités de structure (homologie de chaînes d’acides-aminés ou homologie de structure) § Allergie à une seule protéine peut causer des réactions croisées à d’autres protéines de la même famille. § Allergènes recombinants permettent de se focaliser sur un (ou plusieurs) allergène(s) d’une source : – Disponibilité en CAP (et/ou en ISAC) ou en cours de développement…

En résumé • Les microarrays peuvent nous être profitables, dans des cas difficiles : – 103 recombinants or allergènes naturels purifiés en une seule détermination… § Validation analytique de l’Immuno. CAP© ISAC : ok § L’Immuno. CAP© ISAC a un rôle à jouer dans le diagnostic et le soin aux patients avec des profils de sensibilisation complexes. § Comme cette technique génère potentiellement des résultats inattendus, la réalisation et l’interprétation d’un microarray doivent être évalués en parallèle avec la clinique du patient. • Interprétation des résultats difficile : – Destiné aux spécialistes ! – Nous sommes là pour vous aider…

En résumé • L’Immuno. CAP ISAC est un outil de choix pour évaluer le profil de sensibilisation d’un patient : – Polysensibilisé, atopique – Dont l’anamnèse n’est pas très claire – Dont les prick tests donnent beaucoup de positivités. • L’Immuno. CAP ISAC permet de travailler sur une quantité faible de sérum (20µL) et de gagner du temps. • La technique permet d’éviter les régimes d’éviction trop larges et d’améliorer le confort de vie du patient allergique/atopique… • Intérêt en pneumologie…

En résumé • Les tests de BAT et de CAST ne sont pas à utiliser en première intention. • Ils sont complémentaires aux tests cutanés et Ig. Es. • Intérêt particulier quand ces tests ne peuvent être réalisés ou aboutissent à des résultats douteux en comparaison avec l’anamnèse clinique.

Merci pour votre attention !!