La slection du TOP ovule XIIme journes Ligeoise

La sélection du TOP ovule XIIème journées Liégeoise de Gynécologie Obstétrique Nathalie Lédée

Connaitre le potentiel d’implantation de(s) embryons que l’on va transférer est crucial v Pour augmenter les taux de succès en FIV-ICSI tout en réduisant les risques de grossesse multiple - Pour promouvoir la politique du transfert unique d’embryon -Pour diminuer la mortalité et morbidité maternelle et foetale associée au technique d’assistance médicale à la procréation v L’analyse de la morphologie de l’embryon pre-implantatoire est importante, mais en général insuffisamment informative (Guerif, et al. 2007). v Il n’EXISTE PAS actuellement de marqueur morphologique de l qualité ovocytaire individuelle. La fonction ovarienne est explorée en terme de reserve ovarienne globale v 5% des ovocytes collectés aboutiront à la naissance d’un enfant

De nouvelles perspectives emergeantes tentent de définir la qualité ovocytaire et embryonnaire Granulosa cells Feuerstein et al, 2007 Assou et al, 2008 Hamel et al, 2008 Katz-Jaffe et al, 2006 Dominguez et al, 2008 Tabiasco et al, 2009 Seli, 2007 -2008 Scott, 2008 Embryos conditioned Culture Media Follicular fluids

Cytokines and chemokines dans le liquide folliculaire Randomised population ICSI randomisée (n=71) puis (112) Ponction d’ovocyte: follicule par follicule 530 (puis 953) individual follicular fluids with mature oocytes selection retrospective des liquides folliculaires individuels pour lesquels un embryon avait été obtenu par fecondation in vitro et transféré Echantillons anonymes ont analysés en aveugle Determiner leur concentration de cytokines/ chemokine contents EMBIC plaform (bead-based multiplex sandwich immunoassay - MP piccinni, Florence) Taux d’implantation et de naissance Staging de l’embryon J 2

Est-ce que des biomarqueurs immunologiques seraient informatifs de la compétence ovocytaire ? Cytokines /chemokines/ facteurs de croissance IL-1 beta, IL-1 Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-alpha, TNF-alpha, G-CSF, GM-CSF, VEGF, PDGF, FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin, MIP -1 -alpha, and MIP-1 -beta, LIF Methode Luminex (Elisa en multiplex sur microbilles): Université de Florence par MP Piccini

Un seul facteur folliculaire est apte à distinguer les embryons qui aboutiront à une naissance de ceux ayant échoué : le Granulocyte Colony Stimulating factor (G-CSF ou CSF-3) Au. ROC: 0. 84 [0. 75 -0. 90] (p=0. 0001) • Les embryons qui ont abouti à une naissance avait un taux de G -CSF dans leur liquide folliculaire superieur à ceux n’ayant pas abouti à une grossesse dans 84% des cas. • Définir la sensibilité et specificité optimale du test. L édée et al, Human reprod, 2008

Implantation and delivery rates as a function of the follicular fluid G-CSF concentrations in individual FF From the AUC-ROC curve • Le seuil Bas La specificité la plus haute à prévoir l’échec • Le seuil haut La sensibilité la plus haute pour prévoir le succés Lédée et al, HR, 2008

La variation de concentrations de G-CSF dans une même cohorte EMBRYO CHOICE

Comparaison de plusieurs méthodes de dosages Luminex R&D, Luminex Biorad, Elisa R&D Biorad Luminex technology Au. ROC curve: 0. 82 [0. 73 -0. 89] (p=0. 0001): Excellent discrimination R&D System Luminex at 0. 73 [0. 65 -0. 79] and significant (p=0. 002): Acceptable discrimination G-CSF ELISA, Au. ROC=0. 60, p=0. 19: No discrimination

Comparaison des taux de naissance en fonction du taux de G-CSF folliculaire évalué par trois méthodes differentes. Lédée et al, submitted, 2009

Impact of hyperstimulation * * A oestradiol <1500 pg/ml B- 1500<oestradiol<3000 C- oestradiol>3000 pg/ml

Les cycles de FIV/ICSI en cycle natural modifié comme modèle experimental pour explorer l’environnement de l’ovocyte • Tracabilité du follicule à la naissance est parfaite (1 ovocyte- 1 liquide folliculaire- 1 embryon- 1 enfant) Etude rétrospective en aveugle des liquides folliculaires des follicules dominants- Collaboration avec R. Frydman • Inclusion: les premières 83 tentatives de FIV/ICSI en cycle naturel modifié • Méthode: Multiplex bead-based Assay (Biorad) IL-1 beta, IL-1 Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-alpha, TNF-alpha, G-CSF, GM-CSF, VEGF, PDGF, FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin, MIP-1 -alpha, and MIP-1 -beta, LIF

Protocole: cycle naturel modifié • Monitoring des patientes • Administration of Gn. RH antagonist (Cetrotide) 0. 5 (0. 25 x 2/day) + Gonadotrophins 150 IU/day quand la taille du follicule >13 mm • Administration of h. CG 5000 IU pour la maturation finale Echo HD Gonado. T 150 IU/d Cetro 0. 25/d ≥ 13 mm HCG 5000 IU OR T ≥ 16 mm D 1 Rongières-Bertrand C. , Frydman R. et al, Hum Reprod, 1999 Castelo Branco A. , Frydman R. et al, Fertil Steril, 2005 Mendez-Lozano D. , Frydman R. et al, RBM Online 2008

Caractéristiques des patientes Pregnant group Birth Abortion No pregnancy No oocyte collected No embryo transferred Number of patients 19 6 29 10 19 Mean Age (Years) 33 34 33. 8 33. 7 34. 3 Mean number of previous conventional attempt 2. 5 2 3 2. 4 2. 5 58% - - % of TOP transferred 78% 66%

Trois proteines predictive de l’issue: Naissance par ponction G-CSF (a), and Interleukin-17 (b) and -7 (c) G-CSF Au. ROC: 0. 78 IL-17 Au. ROC: 0. 77 IL-7 Au. ROC: 0. 75

G-CSF, IL-7 et -17 et potentialité de naissance Lédée et al, submitted

Combinaison du G-CSF et de l’interleukine-7 pour predire la naissance

Correlation between G-CSF, interleukin -7 and -17

Cytokines, facteurs de croissance et les chemokines dans le fluide folliculair et la morphologie de l’embryon correspondant Aucun des facteurs n’étaient apte a discriminer les embryons TOP des non TOP quality embryo, D 2 TOP quality embryo, D 3 no TOP Embryos, D 2

Le mécanisme par lequel le G-CSF agit est inconnu • La proteine et le recepteur sont présent dans l’ ovaire - granulosa cells (Salmassi, et al. 2004) / secretion en phase folliculaire préovulatoire • Après la sécretion devient active dans l’endomètre en phase lutéale/placenta avec une augmentation dans le serum si une grossesse survient (Yanagi, 2002 - Salmassi et al, 2005) • Le G-CSF est connu comme une molecule augmentant la tolérance immunitaire avant greffe (T reg cells and dendritic cells recruitment, IL-10 secretion, regulation of complement, control of Th-1 cytokines) Isi l’on considère la grossesse comme une semi-allogreffe, la question d’une tolerance maternelle locale et programmée devient essentielle • G-CSF en injection SC a été montré comme une veritable alternative de traitement dans le cadre des fausses couches à répétition dans un essai randomisée placebo versus G-CSF en simple aveugle (Scarpellini, 2009)

Pour Conclure • Témoins non invasif de la compétence ovocytaire dans le liquide folliculaire existent • Ces résultats ont besoin d’être confirmé par des études prospectives, multicentriques, randomisées. • Si tel est le cas: outil formidable non invasif pour définir la compétence ovocytaire, définir quel femme requiert une hyperstimulation et appliquer une politique de transfert guidée et adaptée a chaque patiente

Collaborative Study supported by the European network EMBIC (Embryo Implantation Control) Nathalie Lédée Gérard Chaouat Sophie Perrier d’hauterive Marie Petit Barat Carine munaut Sylvie dubanchet Francis Frankennes Jean Michel Foidart Marie pierre Piccinni René Frydman Letizia Lombardelli Agnessia Osipova Joelle Taieb