La Reaccin en Cadena de la Polimerasa Lang

La Reacción en Cadena de la Polimerasa Lang, Rodríguez-Vargas, Rezvani Hospital San Juan de Dios Microbiologia I semestre 2008

Técnicas Moleculares Características: n Altamente sensibles y específicas. n Fáciles. n Rápidas.

Técnicas Utilizadas n PCR: 1 -Hot Start 6 -RT-PCR 1 1 -Multiplex 2 -Touch Down 7 -PCR-SSP 12 -QPCR 3 -PCR larga 8 -PCR –SSO 13 -Real Time 4 -in situ PCR 9 -PCR-ARMS 5 -PCR anidada 10 -PCR-RFLP n Genotipaje n Secuenciación

Importancia Clínica De Las Técnicas Moleculares 1) Permite la extracción de material genético (ARN-ADN) de la muestra incógnita para su posterior amplificación detección y cuantificación de la misma. 2) Se pueden detectar mutaciones en el material genético extraído permitiendo analizar la resistencia a medicamentos presentes en los genes virales relevantes. .

Importancia Clínica De Las Técnicas Moleculares 3)Se identifica si hay fallas terapéutica por lo que se hace cambio de esquema de tratamiento a otros medicamentos con un mayor juicio. 4)El tratamiento estaría dirigido más específicamente al conocer su genotipo.

Rxn cadena de la Polimerasa n n Técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, pequeñas cantidades de ADN en el transcurrir de pocas horas in vitro. Ha permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microrganismos, animales y plantas

Historia n n No! Historia no! 1955 : Se descubre ADN polimerasa ( Arthur Komberg). En 1986, Kary Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios. Se trata del PCR: Polymerase Chain Reaction.

Polimerasas n Existen varios tipos de polimerasas n α, β, γ, δ Leen de 51 a 31 n Escriben de 31 a 51 n Para el PCR se utiliza la Taq ADN polimerasa, proviene de arquibacteria Thermus Aquaticus. n

Receta para el PCR. n ADN a amplificar. n Primers que se unan a este ADN Los cuatro nucleotidos: A, C, G, T Polymerasa del ADN n n n Nota: Si es un ARN virus se agrega una retrotranscripatasa antes del PCR.

Pasos del PCR: n La muestra se calienta hasta separar las dos cadenas que constituyen el ADN: desnaturalización. n Luego se agregan segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar: “iniciadores o primers”

Pasos del PCR: n La temperatura se reduce para permitir el "apareamiento“ con los primers. n Extensión: Luego, se utiliza la ADN polimerasa, que activada por la secuencia codificadora de inicio que son ahora los primers, continua replicando el segmento de ADN al cual se unió el primer. Se trabaja a la temperatura optima de la enzima.

n Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado. n Se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. .

El principio de la PCR 100 90 80 70 60 50 Doble Cadena de ADN TA

Desnaturalización. 100 90 80 70 60 50 Denaturation 94ºC

Apareamiento. 100 90 80 70 60 50 Unión de los Primers 55°C

Extensión. 100 90 80 70 Pol 60 50 Pol Extensión 50 -72ºC

Todo queda duplicado 100 90 80 70 60 50 ADN Duplicado 50 -72°C

Y si es ARN? n En este caso (VIH-1 y VIH-2) se utliza una retrotranscriptasa que forma un ADNc a partir del ARN

Aplicaciones en el Hospital San Juan de Dios

PCR en Costa Rica PCR Cuantitativo Cualitativo Carga Viral Genotipaje

Carga Viral Numero de copias de ARN o ADN que se encuentran en una muestra de plasma. n Se utiliza para: n n VIH n Hepatitis By. C n Citomegalovirus n Se utiliza la técnica de PCR Real time

Limites de Cuantificación n Se busca que la carga viral, de los valores mínimos posibles n Ej: n VIH n n 40 -10000 copias Para valores de menos de 40 el tratamiento esta atacando efectivamente al virus por lo que es indetectable a la prueba Valores altos representan resistencia del virus al fármaco o falta de tratamiento

PCR en Tiempo Real v La PCR en Tiempo Real permite el monitoreo del producto recién generado durante el proceso de la PCR a través de nucleótidos marcados con fluorescencia. v El cálculo de los resultados es automático e inmediato.

PCR Real time n n A cada copia de ADN creada por el PCR, la polimerasa la marca con fluorescencia La maquina mide la cantidad de ADN por esta fluorescencia Mucha fluorescencia Carga Viral alta No se toma el Tx Virus posible resistente al Tx Paciente VIH + Poca Fluorescencia Carga Viral baja Siga así!! Se realiza el Genotipaje

Genotipaje Medida cualitativa del virus n Lee la secuencia completa del virus base por base n Identifica mutaciones puntuales y analiza la resistencia del fármaco a esa mutación n Semejante al la farmacogenómica n

Detección VIH Prueba Elisa Positivo Segunda Prueba (+) (-) = VIH- Western Blot (+) = VIH+ CD 4 basal Cada 4 meses <350 inicia TX Carga Viral Cada 4 meses

Otras Aplicaciones

PCR y SSRs

PCR y SSRs

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