La reaccin de PCR y sus aplicaciones Reaccin

La reacción de PCR y sus aplicaciones

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

primers DNA producto PCR: cinética nº ciclos

PCR: diseñando ciclos 92ºC 72ºC 92ºC 55ºC 72ºC 55ºC 92ºC 72ºC 55ºC RT Desnaturalización: Lo mas corto posible Evita inactivación enzima Anillamiento: Lo mas cerca posible de las Tm de los primers Extensión: Lo mas extenso posible para asegurar fragmentos completos

DNA producto primers Enzyme activity PCR: cinética nº ciclos

DNA polimerasas termoestables • Procesividad: 5’-3’ actividad de síntesis • Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa • Adición de As

Procesividad 5’ 3’ 3’ 5’ Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min Pfu polimerasa: 0. 5 Kb/ min Pwo polimerasa: 1 Kb/min

Fidelidad en la PCR 5’ 3’ 3’ 5’ Polimerasa 3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación Taq polimerasa NO 8. 0 x 10 -6 16. 0 Pfu polimerasa SI 1. 3 x 10 -6 2. 6 Pwo polimerasa SI 0. 4 x 10 -6 0. 7

Adición de As -A 3’ 5’ 3’A- -A 3’ 5’ Adición de As: Taq polimerasa: SI Pfu polimerasa: NO Pwo polimerasa: NO -T 3’ 3’T- -T A A T

Optimización de PCR • • • Parametros del ciclo – Minimo numero de ciclos – Las tres reglas Diseño de oligos – Tm’s 55 -80ºC – No concentrar GC en el extremo 3’ Concentración de Mg 2+ (0. 5 -3 m. M) – Demasiado da inespecificidad – Poco da poca producción Coadyuvantes – BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no especificos – Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes ricos en GC) – DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC Mezcla de polimerasas Hot start

Algunas aplicaciones • • Obtener genes – PCR degenerada – PCR reversa Modificar genes – Introducir sitios de restricción – Mutagénesis dirigida – Mutagénesis al azar

PCR degenerada ADRGT 5’ACNGCYTGNTGRCGN 3’ • • • YKILP 5’NTTNCAYGARTCYTT 3’ PCR en condiciones poco estrictas – Temperatura – Mg++ – Concentracion de oligos Diseño de los primers: – Tamaño minimo (21 mer) – Evitar aminoacidos con mas de un tipo de codon – No mas de tres G o C seguidas en los ultimos tres nucleotidos PCR con primers en solitario

PCR reversa

PCR reversa Touch-down PCR Nested touch-down PCR

Nested PCR X bp Y bp Fragmento A: Z pb X bp Fragmento B: Z -(X+Y)pb Y bp

Touch-down PCR 94ºC 60 -65ºC

Introduciendo sitios de restricción RE 2 RE 1 RE 2 RE 1 RE 2

Mutagénesis al azar localizada RE 2 RE 1 RE 1 RE 2 • RE 1 RE 2 RE 1 PCR en condiciones de baja fidelidad – Desbalance de nucleotidos – Mn ++ en vez de Mg ++ – Polimerasas mutantes RE 2 RE 1 RE 2

Mutagénesis sitio-específica MUT 1 RE 1 MUT 2 RE 1+MUT 1 RE 2+MUT 2 RE 1 RE 2