KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREIVANJE MONOKLONSKOG PROTEINA U MM

KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE MONOKLONSKOG PROTEINA U MM I SRODNIM POREMEĆAJIMA – kako koristiti metode i interpretirati nalaze Danica Matišić

DIJAGNOZA MULTIPLOG MIJELOMA OSNIVA SE NA NALAZU KLASIČNOG TRIJASA: q NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU I/ILI URINU q INFILTRACIJE KOŠTANE SRŽI PLAZMA STANICAMA (>10%) q OSTEOLITIČKIH ŽARIŠTA IMUNOKEMIJSKU METODU ZA ODREĐIVANJE RAZREDA I TIPA MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA, PRVI PUT OPISALI SU GRABAR I WILLIAMS 1953. GOD.

LABORATORIJSKA EVALUACIJA MONOKLONSKOG PROTEINA Robert A, Kyle, David F. Keren, Raymond Alexanian, Usha Kallemuchikkal 1. Elektroforeza proteina u serumu i urinu: a) nisko rezolutne elektroforeze b) visoko rezolutne elektroforeze 2. Kvantitativno određivanje imunoglobulina a) Nefelometrijski ili turbidimetrijski b) Radijalna imunodifuzija 3. Definiranje razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina a) Imunofiksacija b) Imunoelektroforeza c) Imunoselekcija d) Imunosupstrakcija: moguća samo uz kapilarnu elektroforezu 4. Kvantitativno određivanje monoklonske komponente a) Denzitometrijski 5. Kontrola kvalitete evaluacije monoklonskog proteina Ključna komponenta interne kontrole: direktan kontakt biokemičara s kliničarem o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo koja diskrepansa u nalazu

Elektroforeza serumskih proteina NACIONALNA GRUPA ZA LIJEČENJE HEMATOLOŠKIH BOLESTI Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković Elektroforeza serum. prot. Vizualni pregled Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Bez promjena Bence Jones protein? Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Elektroforeza proteina u mokraći Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Proteinogram (100 x ukonc. uzorak) Imunofiksacija Negativ. nalaz Prisutan BJ protein Denzitometrijska kvantifikacija M-P Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Imunoelektroforeza Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA (M-P)

1. Elektroforeza proteina u serumu i mokraći indicirana je za svakog bolesnika kod kojeg postoji sumnja na poremećaj plazma stanica. Elektroforeza serumskih proteina može se izvesti nisko i visoko rezolucijskim tehnikama: Nisko rezolucijske elektroforeze: elektroforeza na acetat-celulozi ili agarozi: razdvaja proteine na pet frakcija. Kod ove tehnike nije moguće postići dobro razdvajanje β 1 -(transferin) i β 2 -globulinske frakcije (C 3) Visoko rezolucijske elektroforeze: kapilarna zonska elektroforeza omogućuje bolje razdvajanje transferina i C 3 u području kao i bolje uočavanje niskih koncentracija M-proteina koji mogu putovati od 2 do gama područja

NISKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH PROTEINA 1. Procjena približne koncentracije glavnih serumskih proteina: alb, alfa-1 -AT, Hp, alfa-2 -M, C 3, Tf, Ig. A i Ig. G 2. Detekcija monoklonskog proteina 3. Osjetljivost detekcije monoklonskog proteina je 2 g/L na acetat-celulozi i 1 g/L na agarozi

VISOKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH PROTEINA – KAPILARNA ZONSKA ELEKTROFOREZA + -Visoki stupanj rezolucije posljedica je više faktora: q primjena visokih napona (od 3 -30 k. V) q kontrola temperature q kontrola debljine sloja gela i q sama aplikacija uzorka

Visoko rezolucijski sustavi omogućuju razdvajanje proteina na 10 do 12 frakcija: prealbumin, -lipoprotein, α 1 -kiseli glikoprotein (orozomukoid), α 1 -antitripsin, α 2 - makroglobulin, haptoglobin, transferin, -lipoprotein, C 3, fibrinogen, CRP (kad je značajno povišen) i -globulini koje uglavnom predstavlja Ig. G.

Primjer CZE Figure 1. Electropherograms of a sample with an Ig. M monoclonal protein. (A), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on the Hydrasys system (Sebia); (B), capillary zone electrophoresis (Paragon 2000; Beckman. Coulter); (C), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on the Hydrasys system (Sebia) after mercaptoethanol treatment (10 µL of 1: 10 dilution of mercaptoethanol added to 100 µL of serum). The fractions in panels A and C are albumin, 1 antitrypsin, -lipoprotein, 2 -macroglobulin and haptoglobin, ß-lipoprotein, transferrin, C 3, and the -globulin fraction. The small deflection in the midgamma region is an artifact. The arrow indicates the monoclonal protein.

Vizualni pregled elektroforeze Bez promjena Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Hp-Hb CRP Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Hb Imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili imunosupstrakcija

2. Za definiranje razreda i tipa M-proteina indicirana je imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili imunosupstrakcija koja je moguća samo uz kapilarnu zonsku elektroforezu anoda + Heidelberger-Kendallova krivulja katoda -

-iako je nalaz elektroforeze negativan kod suspektnih bolesnika treba naparaviti IF (Ig. D, Ig. E)) -imunofiksacija nije indicirana ako se ustvrdi poliklonska hipergamaglobulinemija IMUNOELEKTROFOREZA IMUNOFIKSACIJA

Metoda imunosupstrakcije

Imunoselekcija je imunokemijska tehnika kojom se mogu dokazati monoklonski sintetizirani teški lanci. q q U gelu agara, u koji su prethodno dodani antiserumi na vezane lake lance kapa i lambda tipa, elektroforetski se razdvoje proteini u serumu. Pri tom razdvajanju, dolazi do vezanja kompletnih molekula imunoglobulina, dok eventualno prisutni monoklonski slobodni teški lanci ostaju nevezani. U slijedećem koraku izvodi se imunokemijska reakcija precipitacije slobodnih teških lanaca sa specifičnim antiserumom na γ (G), α (A) ili μ (M) teške lance.

3. M-protein je potrebno pratiti denzitometrijski ali IF nije potrebno ponavljati ako se nisu dogodile promjene u migraciji M-proteina ili ako se nije pojavila nova vrpca 2. Nefelometrijski izmjereni Ig: G = 26, 3 g/L A = 0, 43 g/l M = 0, 35 g/L Denzitometrijski izmjereni: Ig. G = 29, 4 g/L κ=8, 16 g/L λ=0, 57 g/L κ/λ=14, 3 (κ =1, 7 -3, 7; λ = 0, 90 -2, 10 κ/λ= 1, 35 -2, 65) 1 1 1 Alb M-prot. 2 2. Nefelometrijski izmjereni Ig: G = 4, 6 g/L A = 14, 9 g/L M = 0, 62 g/L Denzitometrijski izmjereni Ig. A = 19, 1 g/L 2 3 3

4. Za sve bolesnike s poremećajem plazma stanica potrebno je nefelometrijsko ili turbidimetrijsko određivanje Ig da bi se ustvrdila koncentracija ostalih neuključenih Ig Nefelometrijski određeni Ig: G=3, 70 g/L A=43, 4 g/L M=0, 16 g/L Denzitometrijski određen: Ig. A=36, 7 g/L 4 4 4. Nefelometrijski izmjereni Ig: G = 22, 74 g/L A = 0, 14 g/l M = 0, 10 g/L Denzitometrijski izmjer. G = 21, 4 g/L

5. Kod bolesnika s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom i amiloidozom potrebno je pratiti promjene u koncentraciji Mproteina svakih 1 -2 mj. ; dok je kod MGNZ dovoljno je: 1 x u godini G = 26, 3 g/L G = 12, 3 g/L

6. Hiperviskozni sindrom traži zamjenu plazme s indikacijama utemeljenim na kliničkim značajkama (viskozitet i elektroforezu seruma treba napraviti prije nego se plazma zamijeni, radi usporedbe koncentracija M-proteina) Primjer elektroforeze bolesnika s Waldenström m. prije (A) i poslije (B) plazmafereze: A B

7. Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika s M-proteinom koji pokazuju osjetljivost na hladnoću, posebno kod onih sa M-Ig. M.

8. Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije M-proteina: ključna komponenta interne laboratorijske kontrole je izravan kontakt biokemičara i kliničara o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo kakav nesklad u nalazu.

Bence-Jones protein 9. Svim bolesnicima s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom, amiloidozom i srodnim bolestima potrebno je odrediti prisutnost i dnevno izlučivanje BJP (IF: najmanje 100 x ukoncentriranog urina) Monoklonski slobodni lagani lanci imunoglobulina, Bence-Jones proteini, (BJP), su homogena populacija, kapa (κ) ili lambda (λ) tipa, lakih lanaca imunoglobulina koje stvara maligni klon B-stanica.

Sinteza i metabolizam lakih lanaca

Bence-Jones protein Elektroforeza proteina u mokraći (najmanje 100 x ukonc. uzorak) Negativ. nalaz: ako na elektroforetskoj slici 100 x ugušćenog urina ne nalazimo nikakvu suspektnu monoklonsku vrpcu Preporuka je: koristiti 24 satni urin Prisutan protein BJ

Identifikacija BJP imunofiksacijom ili imunoelektroforezom Elf. prot. u serumu Elf. prot. u urinu IE

Serum Free Light Chain Assay in Diagnosis and Monitoring of Multiple Myeloma D. E. Smith, A. R. Bradwell, G. P. Mead, H. D. Carr-Smith Article Archives: 2005, Volume 16, Number 1 Introduction A distinguishing feature of the monoclonal gammopathies is the production of homogeneous populations of immunoglobulins by malignant clones of B-cells. Production of free light chains (FLCs) is an important feature of light chain diseases, such as light-chain myeloma (LCMM), primary systemic (AL) amyloidosis, and light-chain deposition disease (LCDD). However, in a retrospective study of 745 archived samples from patients with plasma cell disorders, 91% had abnormal FLC levels, and 97% had either elevated FLC levels or an abnormal ratio (see Table 1) [1 -3]. Among those patients with intact immunoglobulin myeloma, 96% were found to have either elevated FLC levels or an abnormal ratio. Referentni intervali za slobodne lake lance u serumu:

FREELITE™ Serum Free Light Chain Assays

FREELITE™ Serum Free Light Chain Assays

B: koncentracija lakih lanaca u serumu kod zdravih ispitanika, bolesnika sa NSMM i MMLL kapa i lambda tipa A Osjetljivost SPE Osjetljivost IF A: koncentracija lakih lanaca u serumu kod zdravih ispitanika, bubrežnih bolesnika i bolesnika sa MMLL kapa i lambda tipa B

Kristali Bence-Jones proteina Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima. Microgravity STS-95 Space is the laboratory of the next millennium Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i tehnologijama. STS-80