Krce kwasy nukleinowe w diagnostyce onkologicznej perspektywy i

Krążące kwasy nukleinowe w diagnostyce onkologicznej – perspektywy i wyzwania

Krążące DNA nowotworowe • ct. DNA, circulating tumor DNA • frakcja pozakomórkowego DNA – cf. DNA (cell-free DNA), niekoniecznie pochodzenia nowotworowego • uwalniane z komórek nowotworowych • odzwierciedla materiał genetyczny komórek nowotworowych – mutacje punktowe, wzór metylacji • istotny element tzw. płynnej biopsji

Uwalnianie ct. DNA • • apoptoza nekroza aktywna sekrecja krążące komórki nowotworowe (CTC) • hipoteza genometastazy – transformacja prawidłowych komórek przez wnikające ct. DNA – źródło przerzutowania

Forma i ilość ct. DNA • w większości DNA po • śladowe ilości cf. DNA ze zdrowych tkanek – eliminowane przez fragmentacji fagocyty • około 166 bp – • znacznie więcej DNA z tkanek wielkość DNA nowotworowych – utrudnione nawiniętego na przenikanie komórek nukleosom + linker odpornościowych do ognisk • dominacja degradacji chorobowych apoptotycznej • krótki okres półtrwania – ok. 2 h

ct. DNA a DNA tkankowe • nieinwazyjna i szybka procedura pobrania materiału („płynna biopsja”) • pozyskanie wielu niezależnych próbek z dowolną częstotliwością • w większości identyczne z DNA pozyskanym z bioptatów • obecne przed pojawieniem się objawów choroby • cenne informacje kliniczne

ct. DNA jako biomarkery nowotworowe • identyfikacja specyficznych mutacji i heterogenności guza • ocena agresywności choroby i potencjału przerzutowania • monitorowanie odpowiedzi na leczenie • ocena choroby resztkowej i możliwości nawrotu choroby • wczesne wykrywanie pierwotnych nowotworów? ?

ct. DNA w badaniach przesiewowych • 640 pacjentów ze zdiagnozowanymi nowotworami w różnych stadiach • ct. DNA u >75% pacjentów z chorobą zaawansowaną 87% w przypadku raka jelita grubego • ct. DNA u ok. 50% pacjentów w początkowej fazie • część pacjentów ct. DNA(+) bez komórek CTC Liczba pacjentów z wykrytym ct. DNA. Bettegowda C. et al. (2014)

ct. DNA w badaniach przesiewowych • dość niska czułość metod pomiarowych • bardzo małe ilości ct. DNA u osób w początkowych stadiach → 49 -70% przypadków • znaczny wzrost dopiero w fazie inwazyjnej → 75 -100% chorych • brak ustalonych mutacji kierujących • mutacja onkogenu KRAS w raku jelita grubego • u części osób z mutacją brak zmian neoplastycznych • ryzyko uzyskiwania wyników fałszywie dodatnich

ct. DNA jako marker prognostyczny • grupa 58 osób z nowotworem jelita grubego • u 2/3 przynajmniej jedna zmiana w ct. DNA: mutacja KRAS lub hipermetylacja CDKN 2 A • 2 -letni wskaźnik przeżycia: – 100% u osób bez zmutowanego ct. DNA – 49% u osób z tym ct. DNA • wskaźnik 2 -letniego przeżycia wolnego od nawrotu w zależności od obecności ct. DNA (stadia IIII): 100% i 66%

ct. DNA jako marker prognostyczny • pomiar ct. DNA i CEA po resekcji guza jelita grubego • ocena wskaźnika czasu wolnego od nawrotu choroby • lepsza stratyfikacja chorych do odpowiedniej grupy ryzyka w przypadku ct. DNA Diehl et al. (2015)

ct. DNA a ryzyko przerzutowania • ocena ct. DNA, CTC i CA 15 -3 u 30 pacjentek z przerzutującym rakiem piersi • ct. DNA - 97%, CA 15 -3 – 78%, CTC – 87% pacjentek • ct. DNA z mutacjami somatycznymi

ct. DNA w monitorowaniu choroby • 108 pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego • ocena ct. DNA oraz zmutowanych alleli KRAS/BRAF na początku i przed kolejnymi cyklami chemioterapii • ↓ liczby alleli po kolejnych cyklach • u niektórych pacjentów nowe mutacje – przyczyna nabytej oporności

ct. DNA a odpowiedź na leczenie • wykrywanie u pacjentek z rakiem piersi zmutowanego (TP 53) ct. DNA • ocena choroby resztkowej i odpowiedzi na terapię neoadjuwantową • gwałtowny spadek zmutowanego ct. DNA po 1. cyklu NCT i po operacji • powolny spadek związany z niekorzystnym rokowaniem i krótszym OS

Ograniczenia w wykorzystaniu ct. DNA • brak standaryzacji procedur badawczych – izolacji – przechowywania – detekcji – interpretacji wyników • w wielu przypadkach niewystarczająca czułość i specyficzność ct. DNA w wykrywaniu chorób • obecność w krwiobiegu cf. DNA pochodzenia nienowotworowego

Metody analizy ct. DNA 1. dd. PCR (digital droplet PCR) – reakcja w mieszaninie rozdzielonej na wiele tysięcy kropelek; sczytywanie wyniku w każdej cząstce osobno 2. BEAMing – PCR, hybrydyzacja na kulkach magnetycznych i cytometria przepływowa

Sysmex Inostics - Plasma Seq - BEAMing zestaw komercyjny: ONCOBEAM RAS CRC KIT – 34 mutacje w eksonie 2, 3, 4 genów KRAS i NRAS

mikro. RNA jednoniciowe endogenne niekodujące 20 -25 nt ponad 2000 różnych mi. RNA • regulacja ekspresji wielu genów na poziomie posttranskrypcyjnym • regulacja nawet 30% ludzkich genów • • •

1993 rok - pierwsze poznane mi. RNA u Caenorhabditis elegans – lin-4 i let-7 "C. elegans embryogenesis" by Annie Lam collage from 4 D DIC movie

Funkcje mi. RNA Kontrola ekspresji genów → udział w regulacji: • • • różnicowania komórek apoptozy embriogenezy organogenezy proliferacji angiogenezy http: //www. osel. cz/index. php? clanek=1835

Biogeneza mi. RNA

Mechanizm działania mi. RNA • wyciszanie ekspresji genów • efekt działania uzależniony od stopnia komplementarności dojrzałego mi. RNA do m. RNA → degradacja transkryptu → inhibicja translacji http: //scienceblogs. com/transcript/2006/09/still_confused_about_sirna_vs. php

Zaburzenia ekspresji mikro. RNA

Krążące mikro. RNA • mikro. RNA przedostające się do środowiska pozakomórkowego • zidentyfikowane m. in. w osoczu/surowicy krwi, ślinie, moczu czy mleku • krążą w wysoce stabilnej formie i są łatwe do wykrycia • charakterystyczne profile ich ekspresji w przebiegu wielu chorób nowotworowych

Sekrecja mikro. RNA • bierny wyciek • aktywne wydzielanie

Krążące mi. RNA jako biomarkery • łatwość pozyskania materiału badawczego i detekcji • wysoce stabilna forma w płynach ustrojowych • odporność na działanie endogennych rybonukleaz • trwałość w niekorzystnych warunkach ex vivo • charakterystyczne profile ekspresji w przebiegu wielu chorób nowotworowych • przydatne przede wszystkim w ocenie rokowania choroby i monitorowaniu skuteczności terapii

Rodzaj cząsteczki mikro. RNA Zmiana ekspresji Nowotwory trzustki mi. R-16, mi. R-21, mi. R-155, mi. R-181 a, mi. R-181 b, mi. R-196 a, mi. R-210, mi. R-21, mi. R-200 a, mi. R-200 b ↑ let-7 ↓ Rak jelita grubego mi. R-29 a, mi. R-92 a, mi. R-17 -3 p, mi. R-21, mi. R-222, mi. R-141 ↑ Rak wątrobowokomórkowy mi. R-21, mi. R-122, mi. R-223, mi. R-500, mi. R-92 a, mi. R-375, mi. R-25, let-7 f ↑ mi. R-16, mi. R-199 a, mi. R-195 ↓ Nowotwory piersi mi. R-195, let-7 a, mi. R-10 b, mi. R-21, mi. R-155, mi. R-122 ↑ mi. R-92 a, mi. R-181 a, mi. R-375 ↓ Rak prostaty mi. R-20 b, mi. R-874, mi. R-1274 a, mi. R-1207 -5 p, mi. R-93, mi. R-106 a, mi. R-622, mi. R-1285, mi. R-195, mi. R-26 a, let-7 i. mi. R-141, mi. R-375 ↑ mi. R-223, mi. R-26 b, mi. R-30 c, mi. R-24, let-7 e, let-7 c, mi. R-30 c ↓ Nowotwory płuca mi. R-486, mi. R-30 d, mi. R-1, mi. R-499, mi. R-1254, mi. R-574 -5 p, mi. R-155, mi. R-197, mi. R 182, mi. R-25, mi. R-223 ↑

Rodzaj cząsteczki mikro. RNA Zmiana ekspresji Nowotwory żołądka mi. R-17 -5 p, mi. R-21, mi. R-106 a, mi. R-106 b, mi. R-1, mi. R-20 a, mi. R-27 a, mi. R-34, mi. R-4235 p, mi. R-221, mi. R-744, mi. R-376 c, mi. R-21, mi. R-223, mi. R-451, mi. R-486 , mi. R-200 c ↑ let-7 a, mi. R-218 ↓ Rak przełyku mi. R-10 a, mi. R-22, mi. R-100, mi. R-148 b, mi. R-223, mi. R-133 a, mi. R-127 -3 p, mi. R-21 , mi. R 1246 ↑ mi. R-375 Nowotwory układu krwiotwórczego mi. R-150, mi. R-19 b, mi. R-29 a, mi. R-223, mi. R-320, mi. R-484, mi. R-17 (CLL) ↑ let-7 b, mi. R-523 (AML) ↑ mi. R-720, mi. R-1246 (szpiczak mnogi) ↑ mi. R-15 a, mi. R-16 b, mi. R-29 c, mi. R-32 a (CLL) ↓ mi. R-150, mi. R-339, mi. R-342, let-7 d (AML) ↓ mi. R-19 a, mi. R-19 b, mi. R-20 a, mi. R-17, mi. R-92 a, mi. R-223 (szpiczak mnogi) ↓

Nowotwory trzustki Narzędzia diagnostyczne w wykrywaniu gruczolakoraka: • panel ekspresji 4 mikro. RNA – Potencjał prognostyczny: mi. R-21, mi. R-155, mi. R-196 a, • wysoki poziom mi. R-210 – mi. R-210 ekspresja indukowana hipoksją – niepomyślne • kombinacja biomarkerów mi. R wyniki leczenia i rokowanie -16, mi. R-196 a i CA 19 -9 • nadekspresja mi. R-155 – hamowanie aktywności TP 53 INP 1

Nowotwory jelita grubego Panel mi. R-29 a, mi. R-92 a, mi. R-17 -3 p: • istotna nadekspresja u chorych • różnicowanie raka i zaawansowanych gruczolaków • obniżenie poziomu po resekcji guza • brak powiązania ze stanami zapalnymi i zmianami w innych narządach Znaczenie rokownicze: • wzrost ekspresji mi. R-221 ze spadkiem TP 53 – niekorzystna prognoza • nadekspresja mi. R-141 – skrócenie OS • mi. R-141 i CEA – bardziej precyzyjne wykrywanie przerzutów

Nowotwory wątroby Obniżony poziom mi. R-16 i mi. R-199 a • zaburzenie ekspresji BCL 2 i szlaku sygnalizacyjnego kaspaz • różnicowanie chorych na HCC i CLD • potencjał diagnostyczny większy przy jednoczesnym oznaczaniu AFP i DCP Nadekspresja mi. R-92 a i mi. R 638 • przyspieszenie procesów podziałowych – negatywna regulacja czynnika TP 63 • wskaźnik mi. R-92 a/638 – czuły marker w wykrywaniu HCC

Rak piersi mi. R-195 • specyficzne dla nowotworu • różnicowanie pacjentek chorych i zdrowych • znaczny spadek poziomu po mastektomii mi. R-21 • nadekspresja związana z agresywnym przebiegiem, metastazą i złą prognozą • hamowanie ekspresji supresorów – PDCD 4, PTEN, TPM 1 mi. R-122 i mi. R-375 • ocena odpowiedzi na leczenie • ↓ mi. R-375 i ↑ mi. R-122 – oporność na terapię neoadjuwantową i szybki nawrót choroby (HER 2+)

Rak prostaty mi. R-26 a i let-7 i • różnicowanie pacjentów cierpiących na PCA i mi. R-141 BPH • nadekspresja • odwrotna zależność specyficzna dla tego względem kolejnych nowotworu stopni skali Gleason’a • zmiany poziomu skorelowane z CTC, LDH i PSA

Nowotwory płuca Potencjał diagnostyczny • bardzo wysoka ekspresja mi. R-155, mi. R-182, mi. R 197 – test przesiewowy w kierunku NSCLC • nadekspresja mi. R-574 i mi. R-1254 • wykrywanie już w najwcześniejszej fazie choroby Potencjał prognostyczny • panel 4 mikro. RNA: -486, 30 d, -1, -499 • pomocne w ocenie parametrów prognostycznych: OS i PFS

Szpiczak mnogi Profil mi. R-720, mi. R-1246, mi. R 1308 • pomocne w wykrywaniu choroby, niezależnie od wieku i płci • różnicowanie pacjentów z wykształconym szpiczakiem i z gammapatią monoklonalną o nieokreślonym znaczeniu Skupisko mi. R-17 -92 a • obniżona ekspresja niezależnie od stadium • remisja – przywrócenie prawidłowego poziomu • pomocne przy planowaniu terapii i obserwacji przebiegu choroby

Profilowanie ekspresji krążących mi. RNA • technika q. RT-PCR • analiza mikromacierzy mi. RNA • analiza Northern blot • hybrydyzacja w roztworze • hybrydyzacja in situ http: //www. nature. com/app_notes/nmeth/2006/060328/fig_tab/nmeth 869_F 1. html http: //www. ambion. com/catalog/Cat. Num. php? 1558

Analiza ekspresji krążących mikro. RNA metodą q. RT-PCR • • • izolacja RNA (w tym frakcji mikro. RNA) z surowicy/osocza krwi ocena preparatów RNA synteza c. DNA na matrycy całkowitego RNA ilościowa reakcja PCR z analizą w czasie rzeczywistym analiza i opracowanie wyników

Co jeszcze należy zrobić? • nowe, doskonalsze metody izolacji oraz badań jakościowych i ilościowych • standaryzacja procedur badawczych już istniejących • panele zmian genetycznych i epigenetycznych specyficznych dla danego nowotworu (ct. DNA) • charakterystyczne profile ekspresji obrazujące dany typ schorzenia (mikro. RNA) • wieloośrodkowe badania kliniczne dla oszacowania potencjału diagnostycznorokowniczego

Literatura Alix-Panabières C, Pantel K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. (2016) Chen CZ. Micro. RNAs as oncogenes and tumor suppressors. (2005) Cheng F, Su L, Qian C. Circulating tumor DNA: a promising biomarker in the liquid biopsy of cancer. (2016) Gregory RI, Chendrimada TP, Shiekhattar R. Micro. RNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex. (2006) Han X, Wang J, Sun Y. Circulating Tumor DNA as Biomarkers for Cancer Detection. (2017) Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer (2015) Huang JJ et al. Circulating micro. RNA expression is associated with genetic subtype and survival of multiple myeloma (2012) Jackson RJ, Standart N: How do micro. RNAs regulate gene expression? (2007) Kosaka N et al. Secretory mechanisms and intercellular transfer of micro. RNAs in living cells. (2010) Qu KZ, Zhang K, Li H, Afdhal NH, Albitar M. Circulating micro. RNAs as biomarkers for hepatocellular carcinoma. (2011) Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. (2016) Wang R et al. Cell-free circulating tumor DNA analysis for breast cancer and its clinical utilization as a biomarker. (2017)

Dziękuję za uwagę