KOMPLEMENTFIXAN REAKCE NEUTRALIZACE Lkask mikrobiologie cvien jarn semestr
KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE, NEUTRALIZACE Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU www. mmilab. bl
Osnova �Opakování �Dynamika titru �Komplement fixační reakce �Neutralizační test
Opakování �Přímé metody: hledáme mikroba, jeho části nebo produkty (antigeny, toxiny, . . . ). Infekční agens je přítomno nyní. �Nepřímé metody: hledáme protilátky vytvořené makroorganismem, které vznikly jako odezva na činnost mikroba. Infekční agens bylo přítomno někdy v minulosti.
Přehled nepřímých metod �precipitace (J 08) �aglutinace na nosičích (J 06) �komplementfixační reakce (KFR) (J 09) �neutralizační reakce (J 09) �metody se značenými složkami (J 10): q Imunofluorescence q ELISA q Western blot
Interpretace nepřímých metod �Průkaz antigenu: pozitivita = přítomnost mikroba v těle pacienta �Průkaz protilátek: pozitivita = pacient se s mikrobem setkal. Kdy? Nutno odhadnout dle: q Relativní množství protilátek (titr) a jeho změny v čase (dynamika titru) q Třídy protilátek – Ig. M/Ig. G � Avidita protilátek (na počátku infekce jsou přítomny nízkoavidní Ab)
Interpretace – primární a sekundární imunitní odpověď �Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy Ig. M, případně Ig. M i Ig. G �Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze Ig. G (imunologická paměť) �Chronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod. http: //nfs. unipv. it
Párová a nepárová séra �Párová séra – dva vzorky: první uchováván v ledničce do doby, než dorazí vzorek druhý – rekonvalescentní (v rozmezí 10 – 21 dní). Oba jsou pak hodnoceny naráz. Signifikatní je čtyřnásobný vzestup titru mezi jednotlivými vzorky akutní infekce. �Nepárová séra – dva vzorky, ale nejsou vyšetřovány společně. Zvětšuje se tak riziko náhodné chyby, a proto jako důkaz akutní infekce nestačí čtyřnásobný titr, ale osminásobný titr.
Titr protilátek �Titr = nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci. (Máme-li dvě řady, je titrem nejvyšší ředění z obou řad dohromady. ) �Prokazujeme reakci imunitního systému ta může být velice variabilní mez jednotlivými pacienty. �Málo reaktivní pacient (nízká hodnota titru i v akutní fázi infekce) vs. velmi reaktivní pacient (vysoká hodnota titru i po uplynutí dlouhé doby od prodělán infekce).
Titr protilátek – dynamika titru (1) �Z předchozího slidu vyplývá, že se tedy nelze spolehnout na samotnou výši titru, ale je nutno vycházet z dynamiky výše titru. �Po prvním styku s Ag trvá až 10 dní, než je lze detekovat běžnými serologickými metodami v prvních dnech infekce jsou serologické reakce často negativní.
Titr protilátek – dynamika titru (2) � Velikost a dynamika titru neodpovídají klinickým příznakům!!! � Množství protilátek vrcholí často až po vymizení příznaků. � Lze prokazovat také pokles titru subakutní infekce. � Serokonverze = v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“. Serokonverze vyžaduje, aby pozitivní nález ve druhém vzorku byl o jedno ředění vyšší než základní ředění (např. základní ředění 1: 4, pozitivní nález ve 2. vzorku alespoň 1: 8)
Titr protilátek – dynamika titru (3)
Komplement (1) � Součást nespecifické (humorální) imunity � Systém sérových a membránových glykoproteinů. Nejdůležitější proteiny jsou C 1 – C 9. � Komplement váže komplex Ag-Ab, nemůže samostatně vázat Ag a samostatně Ab. � Fungují v kaskádě: nejprve dojde ke štěpení neaktivní složky na menší biologicky aktivní část (mediátory zánětu C 3 a, C 4 a a C 5 a) a větší proteolyticky aktivní část (proteinové fragmenty b) q konečný produkt: komplex atakující membránu mikroorganismu vytvoří pór lyze buňky q
Komplement (2)
Komplement – aktivace �Liší se od sebe způsobem aktivace C 3 složky. Nejdůležitější moment při aktivaci komplementu je tvorba C 3 b z C 3. � 3 různé cesty aktivace kaskády: q Klasická – aktivace komplexem Ag-Ab, nutná přítomnost protilátek. q Alternativní – aktivace povrchem patogenu, C 3 b slouží k opsonizaci patogenu. q Lektinová– lektiny = proteiny schopny specificky rozpoznávat a vázat volné i vázané cukry.
Komplement fixační reakce �Reakce využívá vlastností komplementu – vazby na komplex Ag-Ab a schopnost komplementu lyzovat buňku. �Samotná vazba komplementu na Ag-Ab komplex není viditelná přidávají se indikátory. �Indikátorový systém je tvořen Ag a Ab, aby se na něj mohl komplement také navázat: q Ag = beranní erytrocyty q Ab = králičí Ab proti beraním erytrocytům (amboceptor)
Komplement fixační reakce – princip (1)
Komplement fixační reakce – princip (2) � Pozitivita: sediment erytrocytů (komplement je vyvázán komplexem hledaného Ag a Ab) � Negativita: hemolýza erytrocytů (nedošlo k vyvázání komplementu zlyzoval ery) � Používá se morčecí komplement, ne pacientův. Inaktivuje se zahřátím tak, aby nebyly poškozeny pacientovy protilátky (30 min/56 minut).
Falešná pozitivita a negativita KFR �Falešná negativita: q Příliš mnoho komplementu hemolyzuje ery i v přítomnosti hledaného komplexu Ag-Ab q Nutná kontrola – titrování komplementu �Falešná q Některá pozitivita: složka séra vyvazuje komplement sama o sobě, případně je sérum kontaminované q Předcházíme tomu testem antikomplementarity = běžně provedený test, ale bez přidání Ag pokud i tak dojde k vyvázání komplementu, nehodnotí se výsledek a krev je odebírána znovu
Neutralizační reakce �Neutralizační reakce: serologické metody, při nichž protilátka brání běžným projevům antigenu (nejčastěji viru) q Virus neutralizační test – Ab neutralizuje infekčnost viru – buněčná/tkáňová kultura je naočkována směsí viru. Pokud je přítomno Ab beze změny (metabolický efekt, p. H, fenolová červeň). q Hemaglutinační inhibiční test – v přítomnost Ab není virus schopne aglutinovat erytrocyty (pozor, ne hemolyzovat!!!) q ASLO = průkaz antistreptolyzinu O (protilátky schopné vyvolat autoimunitní reakci), nejde o nepřímý průkaz!
ASLO – diagnóza pozdních následků streptokokových infekcí �Po každé infekci streptokokem dochází k tvorbě Ab, včetně Ab proti streptolyzinu O = streptokokový toxin �Pokud po skončení infekce stoupá množství těchto Ab, dochází ke zkřížené reakci s některými strukturami organismu = pozdní následky strept. infekcí (revmatická horečka, glomerulonefritida) �ASLO: zjišťuje míru protilátkové odpovědi po prodělané streptokokové infekci – hledáme přímo protilátky, ne patogen.
Úkol 1: Dynamika titru �Každý student má vlastní kartičku �Vyplňte tabulku včetně interpretace výsledků
Úkol 2: Ověření funkce indikátorového systému pro KFR �Jaké složky jsou nutné pro správnou funkci indikátorového systému? �Pozn. Amboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům �Výsledek: � 1), 3), 4) – není hemolýza � 2) – hemolýza
Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (1) �Pacient: dlouhotrvající respirační problémy, minimum klinických projevů. �Nejpravděpodobnější diagnóza: atypická pneumonie (může být způsobena respiračními viry, vzácně některými bakteriemi – Mycoplasma, Chlamydia) �Pokud je agens bakterie, účinkovala by ATB terapie
Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (2) �Celá destička patří jednomu pacientovi. �Testujeme 6 respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (vzorek akutní a vzorek rekonvalescentní). �První sloupec = test antikomplementarity. �Další sloupce = ředění séra. Ve druhém sloupci 1: 5, dále geometricko řadou s koeficientem 2. � 5 virů (chřipka A, chřipka B, parainfluenza, adenovirus, RS virus), 1 bakterie (Mycoplasma pneumoniae).
Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (3) �Odečtěte titry KFR u jednotlivých pacientů. �Zakreslete výsledky, zapište titry, pokuste se interpretovat závěr. �Věnujte pozornost testu antikomplementarity!
Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (4) �Chřipka A: oba titry 1: 5 (pacient se s onemocněním setkal dříve, nejde o akutní onemocnění. �Chřipka B, parainfluenza, adenovirus, RS virus: žádné protilátky, pacient se s infekcí nikdy nesetkal. �Mycoplasma pneumoniae: vzestup titru z 1: 10 na 1: 160 (16 násobný vzestup signifikantní výsledek) podezření na probíhající akutní infekci způsobenou Mycoplasma pneumoniae
Úkol 4: Stanovení protilátek (klíšťová encefalitida) � 3 pacienti s podezřením na klíšťovou encefalitidu. Všichni neurologické potéže, anamnéza po přisátí klíštěte. � 1. řádek = pozitivní kontrola � 2. a 3. řádek = první pacient Karel � 4. a 5. řádek = druhý pacient Leona � 6. a 7. řádek = třetí pacient Monika � První z obou řádků odpovídá akutnímu vzorku séra, druhý rekonvalescentnímu. � 1. sloupec = test antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1: 4 (dále 1: 8, 1: 16, 1: 32, . . . )
Úkol 5: Stanovení protilátek (toxoplasmóza) �Několik pacientů s podezřením na protilátky proti toxoplasmóze. Toxoplasma gondii = tkáňový parazit, definitivním hostitelem je kočka. �Seronegativita = nikdy se s infekcí nesetkal nebo infekce probíhá příliš krátce na detekci protilátek. �Seropozitivita = nutno bližší zkoumání. � 1. řádek = pozitivní kontrola � 1. sloupec = test antikomplementarity (neřešíme dynamiku titru) �Rozhodněte, zdali je výsledek pozitivní/negativní/antikomplementární.
Úkol 6: ASLO (1) �neutralizace hemolýzy �streptolyzin O �za běžných okolností (nepřítomnost protilátek) – hemolyzuje červené krvinky �Negativní = hemolýza �v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat �Pozitivní = zábrana hemolýzy
Úkol 6: ASLO (2) �Odečet destičky = naležato �První řádek je pozitivní kontrola, další řádky jsou jednotliví pacienti �Hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu
Úkol 6: ASLO (3) �Výsledky: �vysoké riziko pozdních následků je u pacientů číslo 3 a 4 (506, resp. 337 m. j. ) �hraniční riziko je u pacienta č. 1 (225 m. j. ) a u pacienta č. 7 (180 m. j. ) �u pacientů č. 2 a 6 riziko prakticky není, titry jsou, ale nízké �pacient číslo 5 se vůbec nesetkal s příslušným antigenem (je-li vyšetřován pro „prodělanou angínu“, šlo nejspíše o angínu virového či jiného nestreptokokového původu)
Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (1) �Několik pacientů s podezřením na klíšťovou encefalitidu, již testovaných pomocí KFR (viz úkol 4) �HIT jako nezávislý test k ověření výsledků KFR (pozor jedná se o jiné pacienty než v úkolu 4!) �V přítomnosti Ab není virus schopen aglutinovat erytrocyty (nikoli hemolyzovat!) �Pozitivní = sedimentace erytrocytů (protilátka zabránila shlukování, erytrocyty sedimentují) �Negativní = shluk krvinek (protilátka nebyla přítomna nebo jí byla příliš málo, nedokázala zabránit viru ve shlukování krvinek)
Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (2) � Odečtěte výsledky HIT u klíšťové encefalitidy – čtyři pacienti (K, L, M, N), u každého akutní a rekonvalescentní sérum � 1. řádek = pozitivní kontrola � 1. sloupec = ředění 1: 5, dále geometrickou řadou s koeficientem 2 (1: 10, 1: 20, . . . ) � Učiňte pravděpodobný závěr (akutní infekce/pouze paměťové protilátky/. . . ) � Kontrola Ag – kontroluje, že antigen (virus) bez protilátky je schopen shlukovat � Kontrola erytrocytů – kontroluje, že erytrocyty neshlukují samy od sebe
Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (3) �Mělo by vyjít: �jeden z pacientů je zřejmě akutně nemocen �dva se s infekcí setkali �jeden se nesetkal
Po tomto cvičení byste měli umět �Vysvětlit, co je dynamika titru. �Rozumět pojmu komplement. �Popsat komplement fixační reakci včetně příkladů jejího použití. �Diskutovat falešnou pozitivitu a negativitu KFR včetně toho, jak těmto situacím zabránit. �Popsat princip neutralizčních testů včetně příkladů. �Znát použití metody ASLO.
- Slides: 35