Klnozs fogalma Egy ltalunk kivlasztott DNS darabot vektor

Klónozás fogalma Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása vektor Hasítás, A, B enzimekkel A inszert A B B ligálás Transzformálás, felszaporítás, tisztítás Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni, Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT VEKTORTÍPUSOK példa plazmidok fonalas fágok fagemidek l fágok kozmidok BAC, YAC p. UC 18, 19 mp 18, 19 p. Bluescript. KS, SK± EMBL 3, 4 p. HC 79 p. BAC 108 L, p. YAC 3 BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome PLAZMIDOK rezisztencia marker replikációs origo ORI Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek inszert méret < 10 - 15 kb < 5 - 10 kb < 10 - 15 kb néhányszor 10 kb néhány 100 kb

Egy ősi plazmid: p. BR 322

Replikációs kontroll

Magas kópiaszámú változat: p. UC 19

Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása -antibiotikum rezisztencia, ld. p. BR 3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges - kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható - plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos - polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció - kék fehér színszelekció, - pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént megszűnik a letalitás - auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

Kolónia hibridizáció

Lac. Z a komplementáció F' plazmidon: defektív b- galaktozidáz gén, hiányzik 11 - 41. aminosav közötti régió bevitt vektor: tartalmazza a lac. Z szabályozó régiót és az 1 -146 aminosavat a kettő együtt: aktív b – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad) ebbe lehet klónozni fragmentumot, ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment X-gal szubsztráttal fehér telep

Egy pozitív szelekciós vektor

Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek - kondicionálisan letális gének használata - vektor defoszforilálása -korrekt vektor/inszert arány megválasztása A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI 1. Kémiai transzformálás Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca 2+, Mn 2+) tartalmazó oldattal kezeljük, sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá : transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNS elvi szám a transzformációt£ 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre normál érték: 106 – 108 nagyon jó: 109 a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők: -oldatok edények tisztasága, - sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete - hősokk hőmérséklete hossza - permeabilizáló faktor a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé egyéb fogások: -spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk - a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt

Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők I. glicerin koncentráció, puffer p. H, puffer koncentráció, sók növesztési hőmérséklet, OD

Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők II. hősokk hőmérséklete, hossza plazmid mérete tárolhatóság permealizáló ágens

Elektroporáció A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású 600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig transzformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása - az impulzus nagysága, hossza - permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása

KONJUGÁCIÓ Sejtből sejtbe történő DNS átadás lépései: párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy speciális sejtfelszíni ponton keresztül (pl. pilus) DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle, az egyik szál átjutása) konjugációs elemek donorból donort csinál az első ilyen a a szex faktor, F episzóma másik: Inc. P csoportba tartozó: RP 4, RK 2 plazmidok (szilárd fázishoz mobilizálható plazmidok a recipiensből nem lesz donor a plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust, ori. T, mob régió tra gének, pilus: N-acetilált Tra. A

A KONJUGÁCIÓ MECHANIZUMSA F pilus + F sejt - F sejt az F plazmid eltörik 5’ 3’ a DNS egyik szála átmegy a recipiensbe, mialatt a donorba a másik szál szintetizálódik 3’ 5’ 5’ DNS szintézis a recipiensben 5’ 3’ 3’ A DNS szintézis befejezõdik a sejtek szétválnak + F sejt F pilus + F sejt 5’

A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során donor recipiens 5’ donor recipiens Tra. I 5’ Töréspont, nick donor Tra. I recipiens Egyszálú DNS kötő fehérje Tra. C primáz 5’ RNS primer Replikatív DNS polimeráz Tra. I

Térképezés konjugációval

Konjugatív génátviteli stratégiák Akceptor konjugáció Donor tra RP 4 elõtt után vektor replikáció az utód sejtben + A konjugáció célja “sima” konjugáció mob RP 4 tra Tn 5 mo b - - Irányított mutagenezis, homológ rekombináción alapuló integráció Random, transzpozon alapú mutagenezis

Mobilizálható vektorok Nem tartalmazzák a tra géneket, csak a transzferhez szükséges ori. T-t tra gének: integrálva a kromoszómába, három komponensű konjugáció: sem a donor sejt sem a recipiens nem tartalmazza a transzferhez szükséges géneket, hanem egy harmadik sejt

Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis Ar 1 ori. V ori. T ori. V: szűk gazdaspecificitás Ar 2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar 2 ori. T ori. V Ar 1 Ar 2 vad típus mutáns poláris hatás

Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül Ar 1 ori. V ori. T ori. V: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia ori. T vad típus ori. V Ar 1 mutáns poláris hatás ?