KLINIKI ZNAAJ KVANTITATIVNOG ODREIVANJA SLOBODNIH LAKIH LANACA IMUNOGLOBULINA
KLINIČKI ZNAČAJ KVANTITATIVNOG ODREĐIVANJA SLOBODNIH LAKIH LANACA IMUNOGLOBULINA Danica Matišić
MONOKLONSKE Monoklonski imunoglobulin B limfocit Plazma stanica Antitijelo GAMAPATIJE Monoklonske gamapatije: mogu biti benigne ili maligne-multipli mijelom Klinički simptomi: od asimtomatskog neprogresivnog stadija do malignog agresivnog multiplog mijeloma Laboratorijska dijagnostika: 1. korak: elf. prot. u serumu ukup. prot. Ig. GAM, IF, β 2 m, kreatinin i Ca u serumu, te BJP u serumu i urinu, SE, KKS, punkcija sternalne ili bedrene kosti
Elektroforeza serumskih proteina KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković Vizualni pregled Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Bez promjena Bence Jones protein? Elektroforeza proteina u mokraći (100 x ukonc. uzorak) Negativ. nalaz Ako na elektroforetskoj slici, najmanje 100 x ugušćenog urina, ne nalazimo suspektnu monoklonsku vrpcu nalaz BJP smatramo negativnim Prisutan BJ protein Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Denzitometrijska kvantifikacija M-P Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA
Dr. Henry Bence Jones Engleski liječnik i kemičar: rođen 31. 12. 1813. ; umro 20. 04. 1873. petak, 30. 1845. - dr. Mac. Intyre i dr Watson Dragi dr. Bence Jones! Epruveta sadrži urin vrlo visoke specifične težine. Kod kuhanja nastaje jako zamućenje. Nakon dodatka dušične kiseline, uzorak se zapjeni, oboji crvenkasto i zatim postane bistar; ali hlađenjem poprima konzistenciju i izgled koji se uočava. Toplina ih oslobađa. Što je to? dr. Bence Jones: The Lancet, 1847. (Dr. Mac. Intyer: 1850. ) eponim Bence-Jones protein koristi se tek nakon njegove smrti 1922. identificirani tip I i II BJP antiserumom imuniziranih kunića 1956. Ouchterlony tehnikom pokazano da se BJP ponašaju isto kao i mijelom-protein i označeni su kao i 2001. imunotest (poliklonska At): mjerenje slobodnih lakih lanaca u serumu
Kristali Bence-Jones proteina Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima. Microgravity STS-95 Space is the laboratory of the next millennium Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i tehnologijama. STS-80
Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca - SLL Razvoj reagensa za kvantitativno određivanje SLL, kapa (κ) ili lambda (λ) tipa, povećao je njihovu kliničku važnost Refer. interv. : SLL κ Refer. interv. : SLL λ Refer. interv. κ/λ SERUM 3, 30 – 19, 40 5, 71 – 26, 3 0, 26 – 1, 65 URIN 1, 35 – 24, 19 0, 24 – 6, 66 2, 04 – 10, 37
KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković Elektroforeza serumskih proteina Vizualni pregled Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Bez promjena Bence Jones protein? FREELITE™ : SLLκ, SLLλ + κ/λ Ako na elektroforetskoj slici, najmanje 100 x ugušćenog urina, ne nalazimo suspektnu monoklonsku vrpcu nalaz BJP smatramo negativnim Elektroforeza proteina u mokraći Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Denzitometrijska kvantifikacija M-P (100 x ukonc. uzorak) Negativ. nalaz Prisutan BJ protein Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA
Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca serumska konc. SLL korelira samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg monoklonskih gamapatija jedan posebno važan aspekt SLL je njihov kratak poluživot: 2 -3 sata za kapu i 5– 6 sati za lambdu; što je 150 x kraće vrijeme od 21 dana koliko je poluživot Ig. G molekule tako konc. slobodnih lakih lanaca omogućuje vrlo brzo procjenu učinka kemoterapije: 92 -128 dana brže nego konc. M Ig bolesnici koji su prema nalazu intaktnog M Ig, u remisiji mogu još uvijek imati povišenu konc. SLL što indicira ostatnu bolest koristeći isti argument, bolesnici čija konc SLL počinje rasti nakon modernog intenzivnog tretmana ide u prilog relapsu bolesti
Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca - DOSADAŠNJA ISKUSTVA 10 -tak godina upotrebe testa za kvantitativno određivanje BJP promijenilo je pristup dokazivanju i praćenju monoklonskih gamapatija FLC test je ugrađen u: dijagnozu-skrining panel prognozu-testiranje i praćenje bolesti Učinak u kliničkoj praksi je bio značajan upravo zbog -povećane osjetljiv. za praćenje bolesti uzrokovanih prolifer. PS -boljeg razlikovanja agresivnih od benignih premalignih bolesti (MGUS) -bolja procjena hematoloških odgovora u monokl. bolest. lakih lanaca kao i pojadnostavljenje testiranja bolesnika Pojava testa je isto tako izmjenila pristup u laboratorijskom testiranju bolesnika
J. A. Katzman - Mayo Clinic KROHEM SKUPINA Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković DIJAGNOZA: – FLC test uklanja potrebu ukoncen. 24 -satnog urina kao i uopće obradu urina. Tako se preporučeni POSTUPNIK za def. “M” proteina treba sastojati od: 1. elektrof. prot. u serumu 2. IF seruma 3. FLC testa u serumu te 4. FLC test u urinu samo kod Elektroforeza serumskih proteina Vizualni regled Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Bez romjena Elektroforeza proteina u mokraći (100 xkonc urin) Negativ. nalaz Prisutan BJP Bence Jones P ? FREELITE™ : SLLκ, SLLλ + κ/λ Imunofiksacija Defi(određ. razreda i tipa) nicija M-P Denzitometrij. kvanti. M-P sumnje na AL amiloidozu Urin će se obrađivati diskontinuirano tj. kod raznih disproteinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je već monoklonski protein identificiran Imunofiksacija Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza DIJAGNOSTIČKI POSTUPNIK ZA DEFINIRANJE MONOKLONSKOG PROTEINA
FLC test je ugrađen u: DIJAGNOZU-skrining panel nadalje su razmatrane opcije i uklanjanja IF iz POSTUPNIKA. Skrining panel sa elektrof. prot. u serumu i FLC testom (uz selektivni izbor IF seruma i urina) je dostatan za dijagnozu multiplog mijeloma i Waldenström makroglobulinemije s malim padom osjetljivosti (od 1%) u dijagnozi AL amiloidoze uz obaveznu procjenu odnosno odluku kliničara. + Elektroforeza proteina u serumu FLC kapa i lambda i kapa/lambda omjer FREELITE: nalaz abnormalan nalaz normalan SPE normalna SPE abnormalna SPE normalna Prisutan BJPMMLL Prisutan intaktni monokl. Ig i/ili BJP Prisutan intaktni monoklonski Ig M-P negativan
FLC nalaz abnormalan SPE normalna
FLC nalaz abnormalan SPE abnormalna
FLC nalaz normalan SPE abnormalna
FLC test je ugrađen u: PROGNOZU -testiranje FLC test u serumu je isto tako koristan biljeg za prognozu progresije MGUS u MM MGUS je premaligna bolest sa brzinom progresije u MM od 1%/god. Brzina progresije kod bolesnika s normalnim omjerom FLC ϰ/λ i “M” Ig <15 g/L je 0, 1%/god. Stoga, ovakve bolesnike ne će trebati podvrgavati kompletnim kliničkim obradama (1 x na god) a ujedno će se moći veća briga pružiti rizičnim bolesnicima. Biti će potrebno napraviti promjene i u laboratorijskoj obradi ovakvih bolesnika.
FLC test je ugrađen u: PRAĆENJE bolesti koncentracija “uključenih” FLC ima važnu ulogu u praćenju bolesti. Ta uloga će biti jedino uskraćena kod bolesnika sa nemjerljivim “M” prot. u serumu ili urinu. Dugotrajno praćenje mjerenja konc. FLC u serumu pokazalo je da se praćenje bolesti može voditi bez obrade uzorka urina. (Skupljanje 24 satnog urina je: mukotrpno za bolesnike i uglavnom netočno)
B. K. 1.
B. K. 2.
B. K. 3 IF BJP urin B. K. 3
K. M. IF BJP urin
M. LJ 1.
M. LJ. 2
Levinson S. Stanley S. Urine immunofixation electrophoresis remains important and is complementary to serum free light chain. Clinical Chemistry and laboratory medicine 2011: 49: 1801 -1804. . I conclude that urine IFE remains important and is complementary to serum FLC assay, although the best algorithms for use remains to be elucidated. IFE BJP kapa IFE BJP lambda IFE BJP poliklonski
Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije M-proteina ključna komponenta interne laboratorijske kontrole je izravan kontakt biokemičara i kliničara o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo kakav nesklad u nalazu.
C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date M. Cook: Eu. LITE trial: results of date Paraproteinemijske bubrežne bolesti dijelimo na: primarne glomerularne i posljedične tubulo intersticijske bolesti. Odlaganje FLC je direktno odgovorno za patološke procese tubulo intersticijskog oštećenja. Nakon filtracije FLC se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endocitoze, FLC budu hidrolizirani i vraćeni kao AK u cirkulaciju. FLC su otrovni: zbog potencijalnih interakcija sa svim dijelovima nefrona; nefrotoksični potencijal FLC je ovisan o njihovoj fizikalno kemijskoj kompoziciji kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze. Ovi faktori određuju tip i težinu oštećenja bubrega Laki lanci uzrokuju intracelularni oksidativni stres(NFκB, MCP 1) varijabilna domena lakog lanca daje interakciju s THP te konačni produkt odlaganja tih kompleksa je nastanak netopivih voštanih cilindara
Diseases associated with monoclonal FLC: AL Amyloidosis; Chronic lymphocytic leukaemia; Non-hodgkin lymphoma S. Kumar: AL Amyloidosis– role of FLC in risk estimation P. Hawkins: FLCs in the amyloidosis Rezultati raznih studija su pokazali da kod primarne AL amiloidoze konc. FLC korelira sa stupnjem zahvaćenosti napadnutog organa i određivanje se provodi: 1. za prognozu bolesti 2. za praćenje bolesti 3. preporuča se uz FLC određivati i troponin T kao i NT-Pro. BNP 4. kvantitativno mjerenje FLC u kombinaciji sa IF seruma i urina je preporučeni protokol kod sumnje na AL amiloidozu u UK (imunohistokemijsko bojenje i dalje ostaje) MM skrining s FLC IF Preporuka Nije nužno urin 24 -satni AL skrining Preporuka Prognoza: Preporuka AL, LCDD, ili oligosekretorni MM Preporuka (AL & LCDD) MM teških lanaca Nije nužno MMLL Nije nužno Preporuka MGUS, AL, MM, Plazmocitom G. Mead: Diseases associated with polyclonal FLC: Hepatitis C; Autoimune bolesti; Hodgkin limfom; AIDS –limfom;
C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date i M. Cook: Eu. LITE trial: results of date -Pokusi in vitro i matematički modeli su pokazali da je uklanjanje FLC hemodijalizom ovisno o veličini pora dijalizacijske membrane: r >5 nm) -Uskoro pojava posebnih membrana za dijalizu tzv. HCO-HD 1100 (high cutt-off haemodialysis) tvrtke Gambro i Ortho-Biotech -razvijen je i poseban European Trial of Free Light Chain Removal by Extended Haemodialysis u nefropatiji uzrokovanoj cilindrima – tzv. Eu. LITE - primarni učinak Eu. LITE triala omogućuje pauze dijaliziranja od 3 mjeseca hemofiltracija ovisi: o protoku krvi; permeabilnosti membrane; hidrostatskom tlaku na membrani; površini hemofiltera (albumin, IL-6, FLC, mioglobin, β 2 m, inulin, vitamin B 12 1, 3 k. D-68 k. D)
C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date -M. Cook: Eu. LITE trial: results of date S. Stringer: Polyclonal FLC and chronic kidney disease - 30 – 40% oboljelih od MM razvije tzv. mijelomski bubreg - propadanje bubrežne funkcije popraćeno je s proupalnim stanjem i kao jedna od posljedica je i poliklonsko stvaranje lakih lanaca -toksičnost monoklonskih FLC je dobro razjašnjena (npr. stvaranje cilindara s THP) za razliku od poliklonski sintetiziranih lakih lanaca -u tijeku su mnoga ispitivanja koja pokušavaju razjasniti ulogu poliklonski sintetiziranih lakih lanaca u stanjima kroničnih bubrežnih bolesti (KBB) -za sada je poznato da poliklonski sintetizirani FLC, za razliku od monoklonskih, ne aktiviraju epitel proksimalnih tubula ali u distalnim tubulima stvaraju cilindre s THP te tako postaju surogat za progresiju KBB posljedica: razvijanje nefropatije te stvaranje ovisnosti o te sklonost infekcijama koji otežavaju liječenje dijalizi
HVALA NA PAŽNJI
- Slides: 29