Kiroptikai spektroszkpia sszelltotta Pl Krisztina 1 Bevezets A

Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina 1

Bevezetés • A kiroptikai spektroszkópiai módszerek jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt. – Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon), – ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében) – CD /cirkuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz függvényében) • Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a polarizált fény közti kölcsönhatás mérésén alapszik. 2

Optikailag aktív, királis anyag • Az olyan anyagokat, amelyek a polárizált fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták összefüggésbe). - Pasteur, tartarát só kristályokból oldat - aszimmetria – optikai aktivitás (1848 -53) (2 R, 3 R)-borkősav ammónium só (2 S, 3 S)-borkősav ammónium só Pasteur rezolválási módszerei: kristályok szétválogatása, sav kristályosítása királis bázissal, bontás baktériummal - Le Bel és van't Hoff (1874); kiralitás és a kémiai szerkezet kapcsolata: aszimmetrikus, tetraéderes C-atom 3

Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir - származik az ilyen szerkezetek királis elnevezése). Optikai aktivitás = forgatóképesség; királis molekulák nem racém halmaza optikailag aktív 4

Királis molekulák egymáshoz való viszonya Enantiomerek: tükörképi pár • Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk; „ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak). • Szimmetrikus környezetben: azonos fizikai és kémiai tulajdonságok • Aszimmetrikus környezetben: különböző tulajdonságok. 5

Enantiomerek spektrumai • Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum. • A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül: – Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik – Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl. diasztereomer képzés, rezolválás alapja) – „Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön • (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak; 1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja eltér. Epimerek: csak egy aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja más) 6

Kiralitás fajtái kiralitáscentrum helikális kiralitás: hexahelicén kiralitástengely kumulén biaril kiralitás-sík 7

A fény polarizációja Nem polarizált fény Síkban polarizált fény y z x Az elektromágneses sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek kölcsönösen merőlegesek egymásra. Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y, x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált. 8

Síkban polarizált fény előállítása A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik). A vertikálisan polarizált komponens átjut. Polarizálatlan fény A horizontálisan polarizált komponens abszorbeálódik (nem jut át a szűrőn). 9

Optikai forgatás • A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve. • nbal≠njobb • Ebből következően a két cirkuláris komponens sebessége más és más, amint királis mintán haladnak át. • n=c/v • Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul ( szöggel). 10

Polarimetria: Az optikai forgatás adott hullámhosszon /589 nm (Na D-vonal)/ 11

Optikai forgatás • Általában specifikus forgatásként van megadva [ ], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon ( , ált. 589 nm) mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva). • Megadása: [ ]D 25 = +65° (c=1. 0, Et. OH) • +, óramutató járásával megegyező irány • – , óramutató járásával ellentétes • Optikai tisztaság meghatározás: – Mért specifikus forgatás*100 tiszta minta specifikus forgatása (Pl. : (+6, 76°/+13, 52°)*100=50%) 12

Aimé Cotton (1869 - 1951) ORD-spektroszkópia, CD-spektroszkópia kifejlesztője 13

Optikai rotációs diszperzió (ORD) • Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében) Detektor: fotoelektron sokszorozó hangolható fényforrás (lámpa + opt. rács) 14

ORD spektrum A + és – sáv közötti tengelymetszet hullámhossza jól egyezik az abszorpciós max –al. . • Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés). • Kromofórt tartalmazó királis minta esetén ún. Cotton effektus (anomália) rakódik a plain curve-re, ott ahol a minta elnyel. 15

CD spektrum • A CD spektrumban A-t, -t (egyezményesen bal- jobb) tüntetik fel a hullámhossz függvényében. (néha az ellipticitást ( ), a moláris ellipticitást [ ]) Abal Ajobb A • Abal Ajobb A /c·l • ( A=Abal-Ajobb) • = bal- jobb =190 -800 nm, e- gerjesztés 16

Enantiomerek CD spektruma • jobb, (R)= bal, (S), bal, (R)= jobb, (S) bal, (R)- jobb, (R) = jobb, (S)- bal, (S) = (S) bal, (S)- jobb, (S)= jobb, (R)- bal, (R)= (R) TÜKÖRKÉPI VISZONY 17

CD mérés (spektropolariméter) 18

UV, ORD, CD összefüggése • Ahol az optikailag aktív anyag elnyel: CD jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus. • Ahol az anyag nem nyel el: nincs CD jel, ORD-ben plain curve. 19

Applications of CD spectroscopy • Determination of enantiomer purity • Determination of absolute configuration • Induced CD signal: binding of an achiral molecule to a chiral molecule – CD bands in the absorption range of the achiral molecule may appear • Protein CD spectra: secondary structure. conformational changes 20

Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás • Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság). • A racém részen felüli túlsúly. 21

Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos? ] • Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba. • Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak. • Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a nemkívánt hatásokért felelős 22

Contergan-botrány (hatóanyag: thalidomide) Racémként hozták forgalomba • A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a hányingert is csillapítja. • Célcsoport: állapotos nők. • Feltűnően sok gyermek született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg visszamaradottan. 23

• (R)-izomer teratogén hatású (S)-izomer hatékony szedatívum 24

Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása • Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R): bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor. • Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító. • Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen – fájdalomcsillapító, tünetenyhítő. 25

Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei • (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyület hasonló, ismert térszerkezetű vegyület. • (2): Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály) • (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennek összevetése a mért spektrummal. 26

Példa (1) Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció (-)-2 a, (2 R, 3 S) abszolút konfiguráció Ismeretlen abszolút konfiguráció 27

Oktáns szabály (ketonokra) (2) • Adott molekulageometriához meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül észlelhető n→π* elektronátmeneté hez tartozó CD jel előjele. Amely térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv. A molekula 3 D modelljét úgy kell elhelyezni a koordináta rendszerben, hogy a karbonil csoport felezőpontja a 3 tengely metszéspontjával egybeessen. 28

Oktáns-szabály alkalmazása (2) (+) (-) Oktáns projekciós diagram (-) (+) Az atomok túlnyomó része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez negatív karbonil sáv tartozik. (Tengelyre eső atomok hozzájárulása 0). 29

Indukált CD • Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS) • Akirális, kromofór vendégmolekula (színezékmolekula, hatóanyagmolekula). • A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az e-átmeneteit perturbálja az akirális molekulának a királishoz kötődve CD-jele indukálódik. 30

Indukált CD cisz-parinársav (kromofór, akirális vendégmolekula) -laktoglobulin (királis host, látható tartományban nincs elnyelése) • A cisz-parinársav (akirális, kromofór), a β-laktoglobulinhoz (királis) kötődik. A látható tartományban (cisz-parinársav elnyelési tartományában) CD jel indukálódik 31

Indukált CD 2 db akirális festékmolekula kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún. exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula kötödik egy fehérjekötőhelyen). Egyre több festékmolekulát hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált CD jel (egyre több festékmolekula kötődik a fehérjén). A CD jel az akirális festékmolekula elnyelési tartományában jelentkezik. 32

Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata: másodlagos szerkezet • Fehérjék esetében a távoli UV tartományban (180 nm - 260 nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet. • 190 -240 nm közt a CD spektrum az amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha másodlagos szerkezet, más a CD spektrum. 33

Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma -hélix rendezetlen szerkezet -turn -redő • Ebben a tartományban (190 -240 nm) adott fehérje CD spektruma a „tiszta” másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineárkombinációjaként írható. 34

Lineárkombináció Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja -hélix -redő rendezetlen szerkezet 35

Illesztés Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék. 36

A ribonukleáz hődenaturációja -hélix rendezetlen szerkezet • Jobbra: 0. 02% Ribonukleáz A, (0. 001 M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 55, 60, 70, 80 °C-on. • Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222 nm-en). 37

Köszönöm a figyelmet! 38