Kinetika Integralni oblik MM jednaine Krive progresa reakcije
Kinetika
Integralni oblik MM jednačine Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja)
1. Enzim mora da bude stabilan tokom čitavog merenja 2. Povratna reakcija mora da bude zanimarljiva 3. Proizvod ne sme da inhibira enzim
Kompetujući supstrati
Specifičnost prema kompetujućim supstratima
Haldanova jednačina Da li ravnoteža u reverzibilnim enzimima katalizovanim reakcijama zavisi od prisustva enzima?
Ravnoteža na površini enzima Ravnotežne konstante na površini enzima su drugačije od konstanti u rastvoru. Razlozi: 1. napon; 2. neproduktivno vezivanje; 3. entropijski faktor
Inhibicije n Izučavanje složenih metaboličkih puteva Izučavanje složenih multisupstratnih reakcija Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i lekovi) - Tipovi inhibicije: n n - - reverzibilna (kompletna i parcijalna) i ireverzibilna (inaktivacija) Tipovi reverzibilne inhibicije: - Kompetitivna - Antikompetitivna - Mešovita - Nekompetativna
Kompetitivna inhibicija Inhibitor (I) i supstrat se vezuju za isto mesto na enzimu Jednostavni MM mehanizam Km se menja, ali ne i Vmax
Linearizovani oblici MM jednačine za kompetitivnu inhibiciju
Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju kompetitivne inhibicije LB metodom
Akompetitivni tip inhibicije n n Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan enzim Uspostavlja se ravnotežno stanje, pri čemu je kompleks ESI u ravnoteži sa ES
Linearizovani oblici MM jednačine za akompetitivnu inhibiciju
Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju akompetitivne inhibicije LB metodom
Mešovita inhibicija (specijalni slučaj – nekompetitivna inhibicija)
Linearizovani oblici MM jednačine za mešovitu inhibiciju
Sekundarni grafici za određivanje Ki i Ki’ u slučaju mešovite inhibicije LB metodom
Značenje Ki n Mešovita inhibicija i efekat mešovitog inhibitora na prividni afinitet E ka supstratu n
Nekompetitivna inhibicija *Inhibitor utiče samo na katalitičku funkciju enzima, ali ne i na vezivanje supstrata *Važan tip inhibicije za multisupstratne enzime *Pri niskim koncentracijama S, efekat inhibitora se može zanemariti
Linearizovani oblici MM jednačine za nekompetitivnu inhibiciju
Sekundarni grafici za određivanje Ki i u slučaju nekompetitivne inhibicije LB metodom
Efekti različitih inhibitora na parametre u MM jednačini Km app. Km a. Km Km/a’ * *Specijalan slučaj: a = a’, nekompetitivna inhibicija, Km se ne menja, Vmax se smanjuje za faktor a’ a. Km/a’
Odstupanje od MM jednačine Inhibicija supstratom
Neproduktivno vezivanje Km i kcat se smanjuju Km je manje od Ks Važi i za reakcione mehanizme u kojima nastaju intermedijeri!
Inhibicija proizvodom Kompetitivna inhibicija proizvodom je posledica reverzibilnosti enzimskih reakcija n Nekompetitivna inhibicija proizvodom n Mesovita inhibicija proizvodom n
Hemijske modifikacije proteina
Ireverzibilni inhibitori specifični za aktivno mesto enzima 1. Brzina inaktivacije je inhibirana supstratom, ili kompetitivnim inhibitorom; 2. Inhibicija prati kinetiku saturacije; 3. Vezivanje je 1: 1; 4. p. H zavisnost inaktivacije je slična kao kod katalize.
Enzimom-aktivirani ireverzibilni inhibitori 1. Hemijski nereaktivni u odsustvu enzima; 2. Aktivirani specifično ciljnim enzimom; 3. U aktivnoj formi reaguju brže sa enzimom nego što disociraju iz kompleksa.
Mihaelova reakcija adicije 1. Enzimi koji sadrže piridoksal fosfat: dekarboksilaze, racemaze, aminotransferaze 2. Monoamin oksidaze i flavoproteini
Praktični aspekti određivanja u enzimologiji n Odredjivanja enzimskih aktivnosti n n Optimalni uslovi Prisustvo supstrata Prisustvo kofaktora Kinetička odredjivanja n Kinetički parametri
Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) n Specifična aktivnost (U/mg) n Koncentracija enzimske aktivnosti U/m. L n Turnover number, molekulska aktivnost (1/min, 1/s) n Aktivnost katalitičkog centra (kcat) n
Prečišćavanje enzima - Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti - Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina - Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena - Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc. , akt. ) - Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći Neke osnovne definicije: Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*. 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s Primer: Ako 0, 1 mg/m. L enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 m. L ima 10 jedinica aktivnosti. Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U /mg proteina. . *Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće: - Temperatura 30 o. C - p. H optimum za dati sistem Enz-Sub Koncentracija substrata na 10 x poluzasićenja substratom (10 Km)
Vrste merenja Kontinualne n Diskontinualne n Direktne n Indiriktne n n Kuplovani testovi
Praktične metode za odredjivanje kinetike i ravnoteže 1. Spektrofotometrija (prirodne hromofore, NADH 340 nm; veštačke hromofore na bazi p. NP estara) – radni opseg instrumenta, Lambert-Ber-ov zakon 2. Spektrofluorimetrija (prirodne fluorofore, NADH 340 nm – 460 nm, Trp 280 nm – 335 nm; 4 metillumbeliferon) 3. Cirkularni dihroizam
4. Kuplovani testovi
n 5. Automatska titracija kiseline i baze n 6. Elektrohemijske metode n 7. Radioaktivne procedure n 8. Manometrijske metode - prati se promena parcijalnog pritiska gasa iznad rastvora n 9. Hromatografske metode
- Slides: 51