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IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta La ricerca degli allergeni negli alimenti: dai metodi tradizionali ai nanobiosensori Dott. ssa Lucia DECASTELLI Struttura Complessa Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni Centro Regionale Allergie e Intolleranze Alimentari IZS Torino Prof. Carlo RICCIARDI Dipartimento di Scienza Applicata e Tecnologia (DISAT) Politecnico di Torino Castello del Valentino, Torino - 2 aprile 2014

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Cosa sono le allergie alimentari Ippocrate… Lucrezio… Accademia Europea di Allergologia ed Immunologia - Reazioni non tossiche - Suscettibilità individuale Intolleranze: enzimatiche, farmacologiche, indefinite Allergie: Ig. E mediate, non Ig. E mediate

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta INTOLLERANZE ALIMENTARI Reazione di ipersensibilità di natura non immunitaria, spesso legata alla quantità di alimento assunto. ALLERGIE ALIMENTARI Patogenesi scatenanti una reazione immunologica, spesso Ig. E mediata

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Sintomi delle allergie alimentari Gastrointestinali Crampi addominali Diarrea Nausea Vomito Coliche Respiratori Congestione nasale Starnuti Asma Tosse Difficoltà respiratorie Cutanei Gonfiore di labbra, bocca, lingua … Orticaria Eruzioni cutanee o rossori Eczema Sistemici Shock anafilattico

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Allergie alimentari: un problema di molti Stati Uniti - 20% popolazione pensa di avere allergie alimentari - 4% adulti e 5% dei bambini : 3 -6 % fino al 10% Europa - 1 -2% adulti e 5 -8% bambini Sottostima legata a raccolta dati non uniforme e diversi approcci diagnostici negli studi clinici

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Allergie alimentari: un problema di molti Italia -in età pediatrica colpisce 6 -8 %; nella popolazione adulta 3% - Alimenti causa di allergia primaria: alimenti vegetali 72% (frutta, legumi, pomodoro) crostacei e molluschi 13%, pesci 4%, Uova e latte 3% cereali 2% anisakis e altri ….

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Evoluzione della normativa Direttiva 2000/13/CE D. Lvo 181/2003 Regola del 25% (ingredienti composti) Direttiva 2003/89/CE D. Lvo 114/2006 Abolizione regola del 25% Direttiva 2006/142/CE D. Lvo 178/2007 Inserimento Lupino e Molluschi Direttiva 2007/68/CE Legge 88/2009 Esclusione di alcuni derivati Reg. CE 1169/2011 In vigore dal 13/12/2014

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IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Working Group EFSA “Food Allergy” • EFSA 2004 “Opinion of the Scientific Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies on a request from the Commission relating to the evaluation of allergenic foods for labelling purposes” • EFSA 2012 “Literature searches and reviews related to the prevalence of food allergy in Europe

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Problematiche Mancanza di limiti quantitativi di legge per i diversi allergeni nell’alimento L’incertezza permane a livello di aziende produttive, di controllo ufficiale e dei consumatori “può contenere tracce di…”

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Attività di controllo ufficiale allergeni in alimenti - Piani di Controllo Ufficiale (Ministero Salute, Regioni) - Piani speciali dei NAS - Indagini a seguito di segnalazione di sintomatologia clinica - Allerte comunitarie

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IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta % positività Controlli ufficiali Reg. Piemonte 2007 -2012 anno

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Detection di allergeni in alimenti: i metodi tradizionali ELISA PCR

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Limiti analitici - Fase di estrazione: effetto matrice e trattamenti tecnologici - Elevata variabilità nelle performance dei test presenti in commercio (Limite di rilevazione o quantificazione diversi) - Mancanza di metodi di conferma ufficiali Necessità di sviluppo di metodi innovativi a supporto delle tecniche tradizionali

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Progetto di ricerca “Messa a Punto di Dispositivi Nanotecnologici (Biosensori) per il Rilevamento di Allergeni in Alimenti di Origine Animale e Vegetale” - la Rete degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali - il Politecnico di Torino - l’Università del Piemonte Orientale - l’Istituto Superiore di Sanità - il Consiglio Nazionale delle Ricerche - la Rete Allergologica della Regione Piemonte Progetto Ricerca Finalizzata Ministero della Salute

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Obiettivi del progetto Messa a punto di metodi analitici innovativi - di screening - CITOMETRIA A FLUSSO - DIGITAL PCR - NANO-BIOSENSORI CANTILEVER - e di conferma - SPETTROMETRIA DI MASSA

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Citometria a flusso La citrometria a flusso è un metodo di conteggio di elementi corpuscolati (cellule) o non corpuscolati (allergeni) adsorbiti a strutture inerti (microsfere lattice). I target vengono marcati con un colorante e fatti passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare e quindi conteggiate. Target Pro Contro Ovoalbumine Lattoglobuline Alti livelli di sensibilità Dispositivi e protocolli dispendiosi

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Citometria a flusso Test per la ricerca di ovoalbumine in prodotti da forno Confronto esiti ELISA accreditato vs citofluorimetria

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Digital PCR La DIGITAL PCR consente la rilevazione e la quantificazione assoluta degli acidi nucleici target combinando diluizioni limite, PCR end-point e statistiche di Poisson Target Pro Contro Crostaceo Alti livelli di sensibilità Necessità di protocolli di estrazione e purificazione

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Digital PCR Test per la ricerca di dna crostaceo in preparato al pomodoro Linearità del metodo in digital PCR

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Spettrometria di Massa La spettrometria di massa consente la rilevazione e la identificazione di sostanze attraverso la separazione di una miscela campione di ioni in funzione del loro rapporto massa/carica Target Pro Contro Ovoalbumine Lattoglobuline Metodo di II livello Conferma Laboratorio attrezzato Iniziato iter di verifica performance e sucessiva validazione Collaborazione tra alcuni laboratori chimici piemontesi

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Nanocantilever …

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Materials and Processes for Micro and Nanotechnology Group (DISAT) • • Missione Ricerca fondamentale su materiali e processi per le micro- e nano-tecnologie Progettazione e fabbricazione di dispositivi e nanosistemi Trasferimento tecnologico Didattica • Nano. Biosensori e Lab-On-Chip http: //www. polito. it/micronanotech http: //www. latemar. polito. it • • • Staff 5 Professori 8 Ricercatori 22 Post Doc 10 Studenti di dottorato 3 Tecnici 2 Amministrativi

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Nano. Biosensori R. Bashir, Adv. Drug Delivery Rev. 2005

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Lab-On-Chip (LOC) STMicroelectronics Nano. Ident Siemens Digital

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Cos’è un cantilever Trave vincolata a una estremità l >> w>> t Produzione su larga scala, con tecnologia a basso costo

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Biosensori a CANTILEVER I. frequenza di risonanza I. Quantificazione della massa Virus, Batteri 1 Hz di shift tipicamente corrisponde a 1 picogrammo di molecole (10 -12 g) Proteine Funghi, Spore Tossine Quantificazione di analiti dai nanogrammi (10 -9 g) agli zeptograms (10 -21 g)

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (I) Obiettivo: sviluppo di un metodo di screening sensibile e quantitativo per la determinazione di allergeni negli alimenti Partner principali: IZSPLVA, CNR-ISPA, Uni. PMN-DSF Research grants: Ministero della Salute 2008 1. Fabbricazione dei Microcantilever in Si 2. Ossidazione termica 3. Silanizzazione (APTES) 4. Linking (GA) 5. Legame con Proteina G 6. Incubazione con Ab (da kit ELISA) 7. Incubazione con il campione 8. Incubazione con Ab (sandwich) b-LG: MW = 18400 – 36800 Da

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (II) Mentre nel saggio diretto gli shift sono coperti dall'alto segnale del blank, dopo il legame con il secondo anticorpo le concentrazioni maggiori di 1 ppm sono ben visibili

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (III) • Curva di concentrazione segue una sigmoide (tipica di saggi ELISA indiretti) • LOD=0, 4 ppm LOQ=1 ppm (confrontabili con ELISA commerciali)

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (IV) Mentre nel saggio diretto gli shift sono coperti dall'alto segnale del blank, dopo il legame con il secondo anticorpo le concentrazioni maggiori di 0, 1 ppm sono ben visibili

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (V) • Curva di concentrazione segue una sigmoide (tipica di saggi ELISA indiretti) • LOQ=0, 1 ppm (migliore di ELISA commerciali)

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (VI) Quantificazione diretta della Valutazione ageing del saggio: densità di anticorpi sulla superficie, diminuzione della capacità di in funzione della diluizione in legame di Ab di circa il 20% in 4 volume mesi LOQ = 0, 5 ppm

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Conclusioni e prospettive future • Nanobiosensori alta sensibilità, basso costo • Lab-On-Chip portabilità, riduzione reagenti, automazione • Nanobiosensori meccanici (cantilever) e allergeni: Con saggi sandwich LOD e LOQ confrontabili o migliori di saggi ELISA commerciali su beta-lattoglobuline Buona riproducibilità Possibilità di quantificazione

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Grazie per l’attenzione Dott. ssa Lucia DECASTELLI Struttura Complessa Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni Centro Regionale Allergie e Intolleranze Alimentari IZS Torino Prof. Carlo RICCIARDI Dipartimento di Scienza Applicata e Tecnologia (DISAT) Politecnico di Torino Castello del Valentino, Torino - 2 aprile 2014