IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ELIJA INSTITUT ZA JAVNO

IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ĆELIJA INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE PROF. DR IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ

IZOLACIJA VIRUSA n n IZOLACIJA VIRUSA JE UMNOŽAVANJE VIRUSA U ŽIVOM SISTEMU I NJEGOVO IZDVAJANJE ŽIVI SISTEMI SU: 1. KULTURA ĆELIJA 2. OPLOĐENA KOKOŠIJA JAJA 3. LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE

Izolacija u kulturi ćelija n Kultura ćelija predstavlja sistem živih ćelija koje žive, metabolišu i razmnožavaju se in vitro u specijalnim hranljivim podlogama.

Uslovi za kulturu ćelija n n 1. sterilnost podloga, pribora i aseptičan rad 2. hranljive podloge medijumi su izotonični rastvori elektrolita koji sadrže razne kombinacije prirodnih i sintetskih sastojaka (serum, glikozu, esencijalne amino kiseline i vitamine, antibiotike, antimikotike i pufere zbog kontrole p. H)

Uslovi za kulturu ćelija n n n 3. Odgovarajuća atmosfera 4. temperatura od 37°C 5. specijalne staklene i plastične posude sa bar jednom ravnom stranom za koju se ćelije kulture mogu prilepiti a zatim nastaviti rast i razmnožavanje

TKIVA n n Za pripremu kultura koriste se razna tkiva: humana i animalna, embrionalna, tumorska Od ćelija najviše se koriste fibroblasti i epitelne ćelije

VRSTE KULTURA n n n 1. PRIMARNE KULTURE 2. KONTINUIRANE ĆELIJSKE LINIJE 3. DIPLOIDNE KULTURE ĆELIJA

PRIMARNE KULTURE ĆELIJA n n n KULTURE ĆELIJA KOJE SU PRVI PUT PORASLE IN VITRO SU PRIMARNE KULTURE ĆELIJA Mogu se dobiti od tkiva ili organa fetusa, adulta ili tumora. Sadrže različite tipove ćelija , što omogućava njihovu primenu za izolovanje brojnih virusa koji pokazuju tropizam za različite ćelije. Mogu se kultivisati još nekoliko puta a zatim propadaju

PRIPREMA PRIMARNIH KULTURA ĆELIJA n n n MEHANIĆKI SE ISITNJAVA TKIVO DELUJE SE PROTEOLITIČKIM ENZIMIMA (TRIPSINOM)KOJI OMOGUĆAVAJU RAZDVAJANJE POJEDINAČNIH ĆELIJA ODSTRANJUJE SE TRIPSIN, ĆELIJE SE KONCENTRIŠU CENTRIFUGIRANJEM ĆELIJE SE SUSPENDUJU U PODLOZI ZA RAST I RAZDELE U ODGOVARAJUĆE POSUDE TERMOSTATIRAJU NA 37°C Za nekoliko dana ćelije se razmnože i stvore na unutrašnjoj površini stakla jedan sloj novonamnoženih ćelija (jednoslojna kultura ćelija)

NEKE PRIMARNE KULTURE ĆELIJA n n BUBREŽNE ĆELIJE RHESUS MAJMUNA (Macaca mulatta) Bubrežne ćelije zeca

Kontinuirane ćelijske linije n Kontinuirane ćelijske linije sadrže samo jedan tip ćelija koje su visoko adaptirane da se razmnožavaju in vitro i mogu se neograničen broj puta pasažirati (subkultivisati)

KONTINUIRANE ĆELIJSKE LINIJE n n n VERO poreklom od bubrega zelenih afričkih majmuna HEP 2 poreklom od karcinoma larinksa He. La poreklom od humanog karcinoma grlića materice RD ćelije poreklom od humanog embrionalnog rabdomiosarkoma BHK-21 bubrega hrčka MDCK BUBREŽNE ĆELIJE PSA

KONTINUIRANE KULTURE ĆELIJA VERO KULTURA ĆELIJA HELA KONTINUIRANA LINIJA

DIPLOIDNE ĆELIJSKE KULTURE n n n U pasažama održavaju originalni diploidni broj hromopzoma i rastu kao jednoslojne kulture ćelija Mogu se in vitro subkultivisati oko 50 -100 puta Diploidne fibroblasne ćelijske linije dobijene od embrionalnih ili fetalnih tkiva se koriste u dijagnostičke svrhe ili za atenuaciju virusa i dobijanje humanih vakcina

VRSTE DIPLOIDNIH ĆELIJSKIH LINIJA n n n Wi-38 MRC-5 NISKE PASAŽE OVIH KULTURA se koriste za dobijanje virusnih vakcina MRC-5 HUMANI DIPLOIDNI FIBROBLASTI

Podela kultura ćelija prema karakteru rasta n n JEDNOSLOJNE KULTURE NASTAJU OD ĆELIJA KOJE IMAJU KONTAKTNU INHIBICIJU TAKO DA TOKOM RAZMNOŽAVANJA FORMIRAJU JEDAN SLOJ VIŠESLOJNE KULTURE ĆELIJA DOBIJAJU SE OD MALIGNIH I TRANSFORMISANIH ĆELIJA KOJE NEMAJU KONTAKTNU INHIBICIJU TE U TOKU RASTA FORMIRAJU VIŠE SLOJEVA ĆELIJA

Suspendovane ćelijske kulture n n DOBIJAJU SE ODRŽAVANJEM ĆELIJA U SUSPENDOVANOM STANJU zahvaljujući stalnom rotiranju boca što onemogućava pripajanje ćelija za zid boce Neki virusi se bolje razmnožavaju u suspendovanim kulturama ćelija nego u jednoslojnim

Razmnožavanje virusa u kultuiri ćelija n n n Inokulacija virusa se vrši ubacivanjem 1 -2 kapi obrađenog bolesničkog materijala u medijum koji prekriva ćelije Inokulisane kulture se inkubiraju na 36 - 37°C Vrednost p. H podloge treba da bude 7, 2 -7, 4

CITOPATOGENI EFEKAT n n Morfološke promene ćelija u kojima se razmnožava virus se nazivaju citopatogeni efekat (CPE) Najčešće promene su: zaokrugljivanje ćelija (dobijaju oblik kugle) i njihovo baloniranje, piknoza jedra i odvajanje ćelija od podloge stvaranje mnogojedarnih džinovskih ćelija pojava citoplazmatskih i nuklearnih inkluzija citoliza

Dokazivanje prisustva i razmnožavanja virusa u kulturi ćelija n n n 1. Inhibicija ćelijskog metabolizma 2. Pojava hemaglutinina u medijumu kulture ćelija ili pojava antigena koji veže komplement 3. Hemadsorpcijom na ćelije u kojima se razmnožavaju virusi 4. Tehnikom imunofluorescencije 5. Interferencijom (virus rubele i echo 11)

IDENTIFIKACIJA UMNOŽENOG VIRUSA n n SEROLOŠKIM METODAMA TESTOVIMA NEUTRALIZACIJE FLUORESCENTNOM MIKROSKOPIJOM Reakcija vezivanja komplementa Inhibicija hemaglutinacije Za serološko dokazivanje potrebna su specifična antivirusna antitela (najbolje monoklonalna)

IZOLACIJA VIRUSA U OPLOĐENOM KOKOŠIJEM JAJETU n n U PRVIH 10 -12 DANA TKIVA JAJETA NISU SASVIM DIFERENCIRANA PA SU PODESNA ZA INOKULACIJU GRAĐA 1. FIBROZNA MEMBRANA (BELA OPNA) 2. HORIOALANTOISNA MEMBRANA 3. AMNIONSKA KESA 4. ŽUMANČANA KESA 5. EMBRION

GRAĐA EMBRIONISANOG KOKOŠIJEG JAJETA

INOKULACIJA n n Do inokulacije jaje se čuva na 38° i vlažnost od 55 -60% INOKULACIJA SE VRŠI U horioalantoisnu šupljinu i na horioalantoisnu membranu amnionsku kesu žumančanu kesu embrion

Inokulacija na horioalantoisnu membranu n n n Embrion je star 10 – 12 dana Inkubacija u termostatu na 35 st. C u trajanju od 48 -72 sata Herpes virusi, virusi variole i vakcinije, virusi koji izazivaju encefalitise

Inokulacija u alantoisnu šupljinu n n Starost embriona 9 -11 dana Inkubira se 2 -5 dana u termostatu na 35 st. C Pre berbe jaje se hladi na 4 st. C Orthomyxo i paramyxo virusi

Inokulacija u amnionsku vreću n n n Embrion star 7 -12 dana Jaje se prosvetli i inokuliše u amnionsku vreću Inkubira se 3 -5 dana na 35 st. C Pre berbe jaje se ohladi na 4 st. C Za orthomyxo i paramyxo viruse

INOKULACIJA U ŽUMANČANU KESU n n n Embrion star oko 6 dana Posle inokulacije Inkubira se na 35 st. C 3 -9 dana Pre berbe se ohladi na 4 st. C Za hlamidije, rikecije i neurotropne viruse

IZOLACIJA VIRUSA U LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA n ŽIVOTINJE KOJE SE KORISTE ZA IZOLACIJU VIRUSA VIRUS RABIESA MIŠ LCM VIRUS MIŠ/ZAMO RAC KOKSAKI VIRUSI SISANCI MIŠA ARBO VIRUSI RAZNI GLODARI

INOKULACIJA U LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE n n ZAMORCI, LASICE, KU NIĆI, KOKOŠI, MAJMUNI INOKULACIJA SE VRŠI PREMA TROPIZMU

INOKULACIJA VIRUSA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA n n n INTRACEREBRALNA INTRAPERITONEALNA INTRANAZALNA INTRAMUSKULARNA INTRAVENSKA

POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE NAKON IZOLACIJE VIRUSA n n OBOLELE ŽIVOTINJE SE ŽRTVUJU TKIVO PREMA KOME INOKULISANI VIRUS IMA TROPIZAM SE IZDVAJA , PREPARATIVNIM METODAMA DOBIJA SE ČIST VIRUS PODESAN ZA IDENTIFIKACIJU KOJA SE SPROVODI SEROLOŠKI (PRIMENOM SPECIFIČNIH ANTIVIRUSNIH ANTITELA)

PREPARATIVNE METODE U VIRUSOLOGIJI n n 1. FIZIČKE METODE (ultrazvuk, odmrzavanje zamrzavanje, tarionik sa tučkom, tkivni mikseri) i HEMIJSKE METODE (Al sulfat, bakar fosfat) 2. FILTRACIJA (BAKTERIOLOŠKIM FILTRIMA pa ultrafiltrima) 3. CENTRIFUGIRANJE (LABORATORIJSKIM CENTRIFUGAMA PA ULTRACENTRIFUGAMA) Elektroforezom i hromatografijom u koloni

INKLUZIJE n n n NAKUPINE VIRUSA ILI DEGENERATIVNI ILI REAKTIVNI PRODUKTI ĆELIJA NA RAZMNOŽAVANJE VIRUSA U NJIMA VIDLJIVE SU SVETLOSNIM MIKROSKOPOM INTRACITOPLAZMATSKE (NEGRIJEVA TELA) ILI INTRANUKLEARNE (herpes virus)