Izolace protein Literatura Scopes Protein Purification Harris Protein
- Slides: 84
Izolace proteinů
Literatura • Scopes : Protein Purification • Harris : Protein Purification Methods – Practical Approach • Deutcher : Guide to Protein Purification • Janson : Protein Purification • Kastner : Protein Liqiud Chromatography
Metody separace proteinů • Vychází z klasických metod chemické analýzy • Uplatňují se zde i speciální metody
Problémy se vzorkem • Komplexnost • Malá množství • Labilita
Plánování separace bílkovin
Cíl izolace • • • Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí
Volba vstupního materiálu • Preparát z daného organismu • Preparát s největším obsahem dané bílkoviny • Preparát s nejmenším obsahem nečistot
Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 1 - 100 % HIC 50 99 1. 99 99 % IEX 25 75 3 1. 5 75 %
Stanovení koncentrace bílkoviny
Kjeldahlova metoda – stanovení N 2 • Mineralizace vzorku – převedení organického dusíku na NH 4+ • Stanovení NH 4+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody
UV spektrofotometrie • 280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů • 180 - 230 nm – peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace
VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát • Destruktivní metoda • Nutná kalibrační závislost
Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu 2+ Měření : 540 – 560 nm 310 nm
Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm
Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm
Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm
Nejčastěji používané metody Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová 0. 5 - 5 okamžitý vývoj Lowryho 0. 05 - 0. 5 pomalý vývoj UV - 280 nm 0. 05 - 2 interference UV – 205 nm 0. 01 - 0. 05 interference Bradfordové 0. 01 - 0. 05 sorpce barviva
Stanovení biologické aktivity Enzymatické, imunologické, toxické, hormonální receptorové atdf.
Vlastní separace
Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace
Vstupní materiál
Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy
Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává
Živočišné tkáně • Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • Jateční zvířata – orgány • Člověk – tělní tekutiny
Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek
Rozbití a extrakce
Bakterie • Záleží na lokalizaci cytoplasma periplasma
Balotina Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit
French (X) press Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk
Ultrazvuk Princip – ultrazvuk (> 20 k. Hz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit
Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H 2 O – bakterie popraskají
Živočišné tkáně • Třecí miska s pískem • Ruční homogenizatory – Potter – Elvehjemův • Mixery • Osmotická lyse - erytrocyty
Rostlinné tkáně • Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, • Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny
Srážecí metody
Srážení • Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu • První metody používané pro separaci bílkovin – Et. OH, (NH 4)2 SO 4 • Filtrace nahrazena centrifugací
Rozpustnost bílkoviny • Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + + + -
Rozpustnost bílkoviny • Vlastnostmi roztoku – p. H, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota
Izoelektrická precipitace + + + - p. I + - - -
Srážení neutrálními solemi vsolování vysolování
Vsolování H 2 O - + - H 2 O + H 2 O - - + H 2 O + + H 2 O
Vysolování
(NH 4)2 SO 4 • Rozpustnost se málo mění s teplotou • Saturovaný roztok 4 M - hustota 1, 235 g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1, 29 g/cm 3) • Levný • Stabilizuje bílkoviny • Relativně čistý
Srážení - dvojstupňově
Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou • Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny H 2 O - + - H 2 O + H 2 O - - + H 2 O + + H 2 O
Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou • COHN – separace plazmatických bílkovin Et. OH • Nutno provádět při T < 0 o. C, při větší teplotě dochází k denaturaci • Dvojstupňově • Přídavky z tabulky nebo podle vzorce
Srážení selektivní denaturací • Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • Denaturační vlivy – T, p. H, org. rozpouštědla • Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat
Tepelná denaturace
Chromatografické metody
Chromatografie • Cvet – separace chlorofylů na Al 2 O 3 1903
Chromatografie
Zařízení pro LPC
Ionexová chromatografie elektrostatická interakce Vazba Eluce + + +
Ionexy • Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO 3 slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO • Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)
Ionexová chromatografie • Nanášení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – gradientová • Zvyšováním iontové síly • Změnou p. H • Afinitní eluce Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna pufru
Hydrofobní chromatografie • Stacionární fáze – - C 8, -fenyl • Mobilní fáze – vodné roztoky 1. 7 M (NH 4)2 SO 4 • Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin
Afinitní chromatografie
Afinitní páry
Afinitní chromatografie nanesení vzorku
Afinitní chromatografie vznik interakce
Afinitní chromatografie vymytí balastů
Afinitní chromatografie eluce
Provedení • Nanesení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna p. H, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanovení K), purifikace
Gelová permeační chromatografie
Gelová permeační chromatografie Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : Mr. A>Mr. B>Mr. C
Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Selektivní permeace Totální permeace
Gelová permeační chromatografie • Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony • Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace
Elektromigrační metody
Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“
Zónová elektroforéza + + A+B+C C B A - A > B > C -
Upořádání Horizontální + -
Upořádání Vertikální + -
Polyakrylamid Složení – kopolymer akrylamidu a N, N, - methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin
Polyakrylamid
SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1. 4 g SDS uniformní náboj na jednotku MW
SDS PAGE
Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Mr Rm
Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy
Izoelektrická fokusace „Elektroforéza v gradientu p. H, částice jsou separováný podle svých p. I“
Izoelektrická fokusace t 1 t 0 - + p. H A A p. I H 3 O+ OH-
Izoelektrická fokusace + tx - p. H H 3 O+ OH-
Izoelektrická fokusace analytická • Provedení - v gelech – PAGE, agarosa • Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení p. I – rozřezání a eluce – p. H elektrody – p. I standardy
Izoelektrická fokusace analytická
Dvojrozměrná elektroforéza p. I 3. 0 p. H Mr 10. 0 I. rozměr IEF II. rozměr SDS-PAGE
Dvojrozměrná elektroforéza p. I Mr
- Rti izolace
- Ngc protein purification
- Enzyme purification
- Protein purification and characterization techniques
- Salting out protein purification
- Digital design and computer architecture
- Scopes trial political cartoon
- Scopes programming language
- 10 uncomfortable truths about the american revolution
- Two nature of educational psychology
- Manfaat pemrograman terstruktur
- What are the 7 principles of communication
- Scopes monkey trial apush definition
- Scopes monkey trial
- Counseling goals
- Water purification
- Violet
- Rowpu water purification system
- Inert gas purification
- Need of water purification
- Ion exchange chromatography
- Purification of plasmid
- Inert gas purification
- Double pot method of disinfection of well water
- Cosmid vector slideshare
- Objectives of water purification
- Citric acid purification
- Orthotolidine arsenite test
- Continuous purification process
- Purification of plasmid
- M.g.a.d full form water
- Salting out proteins
- Benzaldehyde purification
- Purification of plasmid
- Iises air purification
- Purification and characterization of organic compounds
- Introduction of purification of water
- Glycerol purification
- Feminax tesco
- Dna purification overview
- Purification table
- Recristallisation principe
- Plasmid
- Purification table
- Purification adn sur colonne de silice
- Protein-protein docking
- Protein pump vs protein channel
- Tipos de fracturas salter harris
- Sap trade management
- Harris pringle formula
- Harris county touchdown club
- Urban realms model example
- Jennifer beck md
- Hoyt sector model
- University physics harris benson
- Pamela weber harris
- Harris and ross
- Adnan aziz tengku faridah harris
- Salter harris fracture
- Parametitis
- Apv verfahren
- Calvert v wainwright
- Harris peripheral model
- Chapter 15 elimination and gastric intubation
- Comparative and superlative for less
- Who is charles baker harris in to kill a mockingbird
- Carver middle school dress code
- Cs5670
- Multiple nuclei model
- Neil patrick harris birthplace
- Philip harris sussex
- Gregory frank harris pintor
- Rumus bmr mifflin
- Uninvited guest harris burdick
- Lone star college nursing program prerequisites
- Harris county efile
- Harris-benedict -basal metabolic rate calorie calc
- Model sektoral milik homer hoyt
- The harp harris burdick
- George hennard
- Harris family tree
- Modified penn state equation
- Harris burdick captain tory
- Schofield formülü
- Mark harris nvidia