Inventada Mikhail Tswett 1900 para separar distintos pigmentos

� Inventada Mikhail Tswett (1900) para separar distintos pigmentos de la clorofila pasándola por una columna de carbonato de calcio. r o l o C = a m Cro α μ ο χρ o t i r c s E = n i e h p Gra ω φ α γρ

Es la separación de dos o más compuestos químicos en un medio

Fase Móvil: Gas ó Líquido Fase Estacionaria: Inmiscible; es sólido o líquido fijado en un sólido.

La movilidad de los componentes de la mezcla a separar depende de la afinidad química o propiedades / FE & FM Si 1 Componente tiene propiedades químicas = FM, tendrá gran movilidad, es decir, el efecto de retención que provocaría la fase estacionaria sería nulo. El Desplazamiento diferencial de los solutos (Fenómeno de adsorción) al ser arrastrados por una FM sobre una FE, nos permite identificar cuantos componentes tiene una mezcla.

� Cromatografía plana. FE=Placa plana o papel v Cromatografía en capa fina

� Cromatografía en columna. FE=Columna v Según el fluido empleado: v Cromatografía v v v Cromatografía Cromatografía v Cromatografía de Líquidos de de de Líquida Líquida de Intercambio Iónico de alta eficiencia de Exclusión de Adsorción en fase Inversa y Normal de Gases v Cromatografía de líquidos súper críticos

FE= papel de celulosa. FM= disolvente y la mezcla de varios líquidos que contiene agua. Se aplica la muestra sobre el papel Introducción del papel en la cubeta que contiene el disolvente. Éste atraviesa el papel por capilaridad arrastrando los componentes de la mezcla. Separación en función de la afinidad por las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos.

FE= Soporte inerte (Sílica) FM= Eluyente y muestra • Con la ayuda de un capilar de vidrio, una pequeña cantidad de muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del extremo inferior de la placa. 1 2 • Una vez depositada la muestra, se introduce la placa en una cubeta de cromatografía, que contiene en el interior el disolvente con el que va a desarrollarse el cromatograma. • Transcurridos unos minutos, cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo de la placa, se saca ésta de la cubeta, se deja secar. Los diversos compuestos se localizan directamente si son coloreados, o con la ayuda de un indicador o luz ultravioleta, si son incoloros 3

Los compuestos que avanzan a lo largo de la placa se ven atraídos por fuerzas sobre la superficie del adsorbente, interaccionando el disolvente con ambos. Esta interacción competitiva establece las velocidades relativas con que ascienden por la capa de adsorbente, el frente de disolvente y un determinado compuesto. Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos, más intensamente se ven éstos atraídos por

� Eluyentes mas comúnes: � éter de petróleo � Tolueno � dietil-éter, t-butil-éter � Diclorometano � acetato de etilo � n-pentano, n-hexano � Ciclohexano � tetracloruro de carbono � éter dietílico � Cloroformo � Acetona � Iso-propanol � Etanol � Adsorbentes más comunes: �Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) �b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica) �c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina) �d) Poliamidas

Limpieza de las Placas Temperatura Pureza de los disolventes

� La separación por cromatografía de intercambio iónico depende de la adsorción reversible de una molécula de soluto cargada a un grupo de intercambiadores iónicos inmovilizados de carga opuesta. FE = resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. FM = generalmente una solución amortiguadora de p. H

Equilibrio de la matriz Adsorción de la muestra Comienzo de la remoción Fin de la remoción Regeneración de la matriz • p. H, fuerza iónica

� Fuertes: permanecen ionizadas en todo el rango útil de p. H. � Débiles: disminuyen su ionización en función del p. H.

-Gran sensibilidad -Determinaciones cuantitativas exactas -Determinación de compuestos no volátiles (alto Peso Molecular, iones metálicos) o termolábiles. -El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. - La fase móvil fluye a través de la columna estrechamente empaquetada. -Presiones de hasta 1500 – 2000 PSI. -Tiempo de análisis reducido. -Los eluidos se identifican al abandonar la columna por métodos: UV Índice de Refracción Fluoresencia

Resolución Elevada Pequeña capacidad Velocidad Sensibilidad elevada Limita purificaciones a gran escala

� Pureza de materias primas � Industria farmacéutica � Productos de degradación � Metabolitos en medicamentos en muestras biológicas � Análisis toxicológicos � Análisis de muestras medioambientales

-Fase Estacionaria: El material que llena la columna (gel o resina) está formado por partículas con poros de un cierto intervalo de tamaños. -Las moléculas mayores que los poros no pueden entrar en ellos, por lo que "pasan de largo" y avanzan por la columna (eluyen) con mayor rapidez que las de tamaño menor, que pueden entrar en los poros y así realizan un recorrido mayor, progresando más lentamente a lo largo de la columna.

� DETERMINACIÓN DE MASAS MOLECULARES DE ESTRUCTURA 3ª Y 4ª DE PROTEÍNAS PURIFICADAS

� Las moléculas se fijan sobre sustancias insolubles: Alúmina (Al 2 O 3) �Carbón activado �Tierra de Diatomeas (Kieselguhr) �Sacarosa pulverizada �Gel de sílice � � Asociaciones de Van der Waals � Enlaces O H

� Eluyente: Cloroformo � Separa Hexano Éter Etílico substancias No Polares � Columna polar – Disolvente no polar

�Fase inversa (FI) – Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar �Fase normal (FN) – Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar

� Es la más utilizada actualmente. � La separación se basa en interacciones hidrofóbicas entre grupos hidrocarburo de la fase estacionaria y del analito. � Componentes más polares eluyen primero. � La retención aumenta cuando aumenta la hidrofobicidad del analito.

¥ Sílica con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Más empleados: • octadecil (C 18) • octil (C 8). Cuanto mayor es el #C, mayor es la eficacia.

� Agua o solución buffer con: �Metanol �Acetonitrilo �Tetrahidofurano �Acetato de etilo �Acetona Cuanto menos polar es el disolvente, más fuerza eluyente tiene

� Elimina las colas de los picos. � Menos sensible a impurezas en el eluyente. � Se ha adaptado uso de columnas. � HPLC: alta presión para mejorar la resolución y reducir los tiempos de separación.

� Separación compuestos � Farmacéuticos � Bioquímicos � Forenses � Clínicos � Industriales � Purificacion de biomoleculas proteínas y péptidos. � oligonucleótidos � � Desalado � Analisis cuantitativo

� Primera descrita, menos utilizada � Basada en interacción de los analitos con grupos funcionales polares de la superficie de la fase estacionarial originada por fuerzas eléctricas entre dipolos permanentes o inducidos. � El componente menos polar se eluye primero, debido a que es el más soluble en la fase móvil Un aumento de la polaridad de la fase móvil, hace disminuir el tiempo de elución.

Fase móvil apolar Sílica con grupo: � grupo ciano � diol � amino � dietilamino Solventes muy apolares: • hexano • heptano mezclados con solventes más polares: • isopropanol • cloroformo • etilacetato La fuerza de elución de la fase móvil de modifica con n-hexano.

� Herramienta de separación muy potente debido a la amplia gama de eluyentes disponibles que se pueden utilizar para ajustar con precisión la selectividad de una separación. � Se ha dejado de utilizar debido a su complejidad. �Período de equilibrado prolongado �Problemas de reproducibilidad �Sensibilidad de la técnica a presencia de pequeñas concentraciones de contaminantes polares en la fase móvil. � Si esto se controla, se obtiene cromatogramas mejores a los de fase reversa debido a la baja viscosidad de los eluyentes que se utilizan habitualmente.

� Separación � de: PAHs (Hidrocarbonos Policíclicos Aromáticos). Analizar trazas de sustancias potencialmente cancerígenas y mutagénicas en aire, agua y efluyentes. �Lípidos �Alcanos �Esteroides �Azúcares

� Es la técnica para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles � Se produce como consecuencia de la interacción de los componentes de una mezcla vapor en una fase móvil gaseosa inerte, con una fase estacionaria (sólido/líquido) de alto punto de ebullición sobre un sólido inerte

Gas portador: Medio de transporte de los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico. Debe ser inerte: Ar, He, N 2 � � Columnas � Capilares: Sílice fundida. Diámetros interiores: 200 -250 mm. Longitud < 20 m. � Micro-empacadas � Tubulares abiertas � Empaquetadas Tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio. Diámetros interiores 1, 6 -9 mm. Longitud > 3 m. Se rellenan de un material adsorbente adecuado.

A MENOR DIÁMETRO, MAYOR EFICIENCIA Y RESOLUCIÓN EL INCREMENTO DE LA LONGITUD DE LA COLUMNA INCREMENTA EL NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS, Y ASÍ LA RESOLUCIÓN

Fases estacionarias Separaciones por punto de ebullición de compuestos en un intervalo amplio de pesos moleculares: Escualano Polidimetilsiloxano Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos polidifenildimetilsiloxano policarboranometilcianoetilsilicón Para compuestos nitrogenados poliamida policianoetilmetilsilicon Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos polietilenglicol pentaeritritol tetracianoetilado

Conductividad térmica Espectroscopía de masas Detector de captura de electrones (ECD)

Cromatografía líquidos supercríticos La Tc de una sust. es la temp. por encima de la cual no puede existir en fase liquida independientemente de la presión. La Pc es presión de vapor de una sust. a su Tc. Una sustancia a T y P por encima de su Tc y Pc (punto critico) = FLUIDOS SUPERCRITICOS

Es una modalidad híbrida entre cromatografía de gases y de líquidos que combina mejores características de cada una de ellas y permite la separación y determinación de compuestos que no son manipulados esas cromatografías. Compuestos no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable. Compuestos con grupos funcionales no detectables por técnicas espectroscópicas o electroquímicasempleadas en cromatografía de líquidos.

Equipo instrumental de cromatografía de fluidos supercríticos. Parecido al de HPLC con los mismos límtes de temperatura y presión

• Horno: mantener la columna termostatizada y controlar la temperatura de la fase móvil. • Restrictor (contrapresión): mantener la presión en la columna y convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector. Un restrictor para columna tubular abierta de 50 -100 μm consiste en un capilar de 2 -10 cm. De longitud y 5 - 10 μm de diámetro el cual esta directamente unido al extremo final de la columna • Microprocesadores: instrumentales. permiten control de variables • Detectores : ionización de llama respuesta universal a compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad. Los espectrómetros de masas se pueden adaptar como detectores mas fácilmente para SFC que para HPLC.

Fase móvil � Columnas abiertas: similares a las columnas de sílice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. � Columnas rellenas. CO 2 Disolvente excelente para moléculas orgánicas no polares. Tc = 31º ; Pc =72. 9 atm. Lo cual permite jugar con una banda amplia de temperaturas y presiones.

Separación de: * * Fármacos Alimentos Pesticidas Herbicidas * Tensoactivos * Polimeros * Explosivos * Propelentes