Introduzione plasmidi circolari di lievito plasmide 2 m

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Introduzione • plasmidi circolari di lievito • plasmide 2 m: ripartizione e regolazione del

Introduzione • plasmidi circolari di lievito • plasmide 2 m: ripartizione e regolazione del numero di copie • plasmide p. KD 1: ripartizione e ricombinazione • plasmide p. KD 1: inattivazione ricombinasi • plasmide p. KD 1: sovraespressione ricombinasi?

Costruzione del vettore Integrativo p. LAU 16 Costruzione del ceppo Integrativo BT 16 Ceppo

Costruzione del vettore Integrativo p. LAU 16 Costruzione del ceppo Integrativo BT 16 Ceppo MW 98 -8 C integrazione Ceppo BT 16 trasformazione

ANALISI DEL CEPPO INTEGRATIVO BT 16 Stabilità del fenotipo Ura+: 100% Ceppo BT 16

ANALISI DEL CEPPO INTEGRATIVO BT 16 Stabilità del fenotipo Ura+: 100% Ceppo BT 16 Crescita su glucosio o galattosio rispetto al ceppo parentale MW 98 -8 C Analisi del DNA integrato (Southern DNA cromosomale) INDUZIONE DEL GENE A SU GALATTOSIO 10 VOLTE

VETTORI DI ESPRESSIONE PER LE PROTEINE ETEROLOGHE INTERLEUKINA 1 - E GLUCOAMILASI

VETTORI DI ESPRESSIONE PER LE PROTEINE ETEROLOGHE INTERLEUKINA 1 - E GLUCOAMILASI

ANALISI DEI TRASFORMANTI: Stabilità e Numero di copie vettore IL A-IL GAM IL A-IL

ANALISI DEI TRASFORMANTI: Stabilità e Numero di copie vettore IL A-IL GAM IL A-IL ceppo fonte C BT 16 Gal Glu wt Gal Glu Ura+ 99 100 100 G 418 95 100 78 89 97 100 99 99 98 96 * = rapporto numero di copie galattosio/glucosio Ratio* 6. 6 11 6. 7 1. 4 1. 5

AUMENTO NUMERO DI COPIE SU GALATTOSIO: Analisi Southern dei trasformanti p. GM-IL p. GM-GAM

AUMENTO NUMERO DI COPIE SU GALATTOSIO: Analisi Southern dei trasformanti p. GM-IL p. GM-GAM R = rilassato S = superavvolto

VERIFICA AMPLIFICAZIONE SU p. KD 1 PM 6 -7 A (cir+) BT 16 (gene

VERIFICA AMPLIFICAZIONE SU p. KD 1 PM 6 -7 A (cir+) BT 16 (gene A, cir 0) incrocio diploide meiosi Segregante GMB 1 (gene A, cir+) Gal/Glu 3 - 4 volte aumento copie p. KD 1

MISURA della GLUCOAMILASI Sopranatante + Tampone + Amido t 1 prelievo t 0 t

MISURA della GLUCOAMILASI Sopranatante + Tampone + Amido t 1 prelievo t 0 t 2 prelievo + I 2 t 3 prelievo + I 2 t 4 prelievo + I 2 A 580 A 580

PRODUZIONE DI GLUCOAMILASI tempo fonte C GAM# 24 Gal 0 Glu 0 48 Gal

PRODUZIONE DI GLUCOAMILASI tempo fonte C GAM# 24 Gal 0 Glu 0 48 Gal 59 Glu 0 72 Gal 113 Glu 14 # = Attività glucoamilasica (m. U/ml) * = Rapporto numero di copie Ratio* 6. 7 4. 5 6. 5 G 418 100 99 90 99 82 100 Ura+ 92 98 38 99 31 99

PRODUZIONE DI INTERLEUKINA da promotore inducibile PHO 5 1° FASE: crescita su galattosio +

PRODUZIONE DI INTERLEUKINA da promotore inducibile PHO 5 1° FASE: crescita su galattosio + alto fosfato Induzione gene A Biomassa e aumento Numero di copie 2° FASE: crescita su glucosio + basso fosfato Induzione gene IL-1 PRODUZIONE

INTERLEUKINA SECRETA

INTERLEUKINA SECRETA

INTERLEUKINA TOTALE IMMUNOREATTIVA (test ELISA) clone fonte C 1 Gal Glu 2 3 IL-1

INTERLEUKINA TOTALE IMMUNOREATTIVA (test ELISA) clone fonte C 1 Gal Glu 2 3 IL-1 totale g/ml pg/cell 101 1. 7 40 0. 15 69 1. 0 40 0. 12 97 0. 9 45 0. 12 secreta (%) 87 90 75 76 80 78

DISCUSSIONE dei RISULTATI Produzione di Proteine Eterologhe da vettori repicativi: importanza della stabilita' a

DISCUSSIONE dei RISULTATI Produzione di Proteine Eterologhe da vettori repicativi: importanza della stabilita' a lungo termine e del numero di copie Il controllo del numero di copie di p. KD 1 corrisponde al modello di 2 m Numero di copie sotto induzione del gene A: problema della saturazione Aumento numero di copie aumento del prodotto (GAM e IL-1 ) Confronto S. cerevisiae vs K. lactis: 1 -2 mg/L vs 100 -400 mg/L (IL-1 ) Problemi tecnici: biomassa da galattosio insufficiente espressione simultanea di gene A e gene eterologo Morlino GB et al. Inducible amplification of gene copy number and heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 4808 -4813