Introduction aux biopuces et lanalyse du transcriptome Emmanuel

Introduction aux biopuces et à l’analyse du transcriptome Emmanuel Prestat Transcriptome

Les différentes puces • • Mesures d’expression Etude du nombre de copies Analyse de polymorphisme Puces à tissus, à cellules, à immunoprécipition Transcriptome

Mesures d’expression • Biopuces les plus utilisées à ce jour (premières auxquelles on pense, quand on parle de puces à ADN) • Principe : – les sondes, petits fragments d’ADN (20 à 50 nt) complémentaires à chaque gène ciblé, sont déposées sur une lame de verre, type lame de microscope ; – Les cibles, ARNm ou ADNc issus d’ARNm, sont marquées (radioactivité ou fluorescence) puis hybridées avec la lame sur laquelle les sondes sont déposées Transcriptome

Transcription Transcriptome

La technologie des puces bifluorescentes Transcriptome

Dépôt des sondes ( « spotting » ) Transcriptome

Dépôt des sondes ( « spotting » ) Transcriptome

Puces à oligo : pas de « spotting » ! Procédé Affymetrix (et Nimble. Gene…) Transcriptome

Particularités des puces Affymetrix • La fabrication in situ des sondes • Leur ultra-haute densité : jusqu’à 1, 3 millions d’objets • Leur design : – Objets carrés – Pas d’espace entre eux – Concept de probeset – Concept de PM et MM Transcriptome

Puces Affymetrix Transcriptome

Préparation des échantillons (cibles) • Extraction d’ARN Kit • Amplification PCR • Marquage – Radioactivité (S 35, P 32) – Fluorescence (Cy 3 - vert, Cy 5 - rouge) En général réalisé en même temps que l’amplification: utilisation d’une amorce de PCR marquée • Digestion (λ-exonucléase) ADN simple brin Transcriptome

L’hybridation • Séchage des cibles et reprise dans un tampon d’hybridation • Volume d’hybridation : 3 à 50 μl (entre lame et lamelle) attention à l’évaporation ! à répartir sur l’ensemble de la surface de la puce • Température d’hybridation 45 65°C – + la température ↑, + le signal d’hybridation ↓ – + la température ↓, + l’hybridation aspécifique ↑ • Temps d’hybridation 1 h 12 h dans une chambre d’hybridation Transcriptome

Le lavage • Après hybridation, lavage de la lame, pour éviter – L’adsorption de fluorescence sur le support – Les hybridations aspécifiques • Conditions de lavage : – Dans des solutions de plus en plus stringentes • Evaluation de la qualité du lavage (et de l’hybridation) – Témoins positifs et négatifs – Répartition aléatoire sur la lame vérification : pas d’effet de localisation, de bord Transcriptome

Acquisition des images Excitatio Laser n 1 2 Fluorescen Émission Fluorescen ce verte Amplification du ce rouge signal (PMT) (Ech 2) (Ech 1) Extraction des Transcriptome données

Acquisition des images Etat excité Etat stable Spectre d’excitation & Spectre d’émission Transcriptome

Choix des fluorochromes Fluorescence verte Fluorescence rouge Transcriptome

« Vrais » images et images d’ « interprétation » Transcriptome

Pas si simple… Transcriptome

Pas si simple… Queues de comètes Bavures Mauvais blocage du processus pendant la phase d’hybridation Sondes/Cibles Spotting ? Lavage ? Transcriptome

…etc Pas si simple… Transcriptome

Différences avec les puces radioactives • • Marquage radioactif (!) Une seule condition expérimentale Le support est une membrane Maximum : 2400 dépôts par membrane (on les appelle parfois les macroarrays) Transcriptome

Extraction des données à partir de l’image 1. Adressage – Localisation 2. Segmentation 3. Extraction de l’information (pour chaque spot) 4. - signal d’intérêt 5. - bruit local (autour de chaque spot) 6. Transcriptome - morphologie (surface, périmètre…)

Méthodes de segmentation Cercles fixes Transcriptome

Méthodes de segmentation Cercles fixes / rotation & distorsions ! Gene. Pix Pro 4. 0 Cercles fixes / variabilité du spot Transcriptome

Méthodes de segmentation Cercles adaptables : modifier position du cercle modifier la taille du cerle Transcriptome

Méthodes de segmentation Dérivée seconde Détection de contours Transcriptome

Méthodes de segmentation Détection de contours vs cercles fixes Transcriptome

Méthodes de segmentation Adams R et Bishof 1994 http: //www. ch. embnet. org/…. . Détection de régions (graines ou agrégation Transcriptome de pixels)

Méthodes de segmentation Détection de régions (Watershed Function) Morphologie mathématique Détection de régions : seuillage (ou histogrammes) Transcriptome

Mesure du bruit de fond Transcriptome

Quelques chiffres Diamètre des spots : 100 -600 µm Capacité totale : 30000 spots / lame ; 2 -10 ng ac. nucl. /spot Distance entre les spots : 100 µm – 600 µm Durée de conservation : 9 mois Conditions optimum de conservation : 2 – 8 °C Durée totale de préparation : 3 jours Préparation d’un échantillon : 2 jours Hybridation : 16 heures Lavage : 1 heure Scan : 5 - 15 minutes Transcriptome

Normalisation de biopuces : pourquoi ? «Traitement visant à ajuster les données selon les effets des variations dues à la technologie plutôt qu’à des différences biologiques » Yang et al. 2002 Transcriptome

Normalisation de biopuces : pourquoi ? Transcriptome

Normalisation de biopuces : pourquoi ? Effet microplaque (ou aiguille) Transcriptome

Normalisation de biopuces : pourquoi ? Transcriptome

Normalisation de biopuces : pourquoi ? Après normalisation qui tient compte de la variabilité due aux différentes aiguilles du « spotter » . Transcriptome Rmq : la normalisation inter-lames observe le même principe

Analyse de données • Identification de gènes DE – Fold change – Tests statistiques • Identification de gènes DE (plus de 2 conditions) • Répétitions (quel type, combien ? ) Transcriptome

Fold change • Avantage : sens pour un biologiste • Fold Change =expression value sample 1/ expression value sample 2 • Décision : – Quel seuil ? – Même pour tous les gènes • Inconvénients – Seulement les valeurs moy, sans tenir compte de la variabilité sont considérées – Les gènes ayant une expression très variable, ont plus de chance de dépasser le seuil aléatoirement Transcriptome

Tests à un facteur Transcriptome

Tests à un facteur • Paramétriques – Condition de normalité Transormation Log => Transformer les données ! Transcriptome

Tests à un facteur • Tests non paramétriques – Ne supposent pas la normalité – Ne supposent pas l’homoscédasticité – L’utilisation des rangs à la place des valeurs d’intensité : • Diminue l’effet des outliers • Ne sont pas affectés par la log-transformation – Pas recommandés si les échantillons ont peu de répétitions Transcriptome

Volcano plot • Combine les p-values et fold changes • Qu’est-ce qui est biologiquement important ? – La significativité des différences – Leur valeur • Quels seuils ? – Combien veut-on identifier de gènes ? – Où sont les contrôles ? • Le t-test modéré fait quelque Transcriptome -chose de similaire

Quel seuil de p-value choisir ? • Dépend du type d’erreur – Type 1 • Faux positifs • => identifie des gènes différentiellement exprimés alors qu’ils ne le sont pas – Type 2 • Faux négatifs • => ne détecte pas certains gènes pourtant différentiellement exprimés dans la réalité Transcriptome

Correction des tests multiples • Le problème… – Ho = l’expression moyenne du gène X est la même pour toutes les populations comparées – Identification des gènes DE : autant de tests à faire que de gènes considérés – Nombre moyen de faux positifs : G. • Exemple – G = 25000 gènes – = 0. 05 => G. = 1250 faux positifs… Transcriptome

Correction des tests multiples • Méthodes de correction des p-values – Correction FWER (Family-Wise Error Rate) • FWER = proba- d’obtenir au moins 1 faux positif • Méthodes utilisées : – Bonferroni step-down (Holm) – Westfall and Young permutation – Correction FDR (False Discovery Rate) • FDR = taux attendu de faux positifs • Méthode utilisée – Benjamini et Hochberg Transcriptome

Lequel utiliser ? • FWER: ne tolère pas de faux positifs (Ho est difficilement rejeté) => procédure très conservative • FDR : moins conservatif, on estime le pourcentage de FP parmi les gènes « appelés » • Aucun : le pourcentage de FP estimé sur l’ensemble des Transcriptome gènes testés

Tests bi-facteurs • ANOVA – Comme un t-test avec + de deux conditions – Mesure les effets de différents facteurs ainsi que leurs interactions – ANOVA 2 • Test deux facteurs • 3 tests – Temps – Traitement – Interaction entre les 2 (additif ? Multiplicatif ? ) Transcriptome

Importance des répétitions Transcriptome

Classification • But : Regrouper une collection d’objets de façon à ce que les objets d’une partition soient plus liés entre eux qu’avec les objets d’une autre partition • Analyse discriminante (classification supervisée) : les classes sont définies • Classification (non-supervisée) : on ne connaît pas les classes Transcriptome

Classification • Exemples : – Traitement/contrôle, malade/normal, thérapie efficace/sans succès, … – Si on a des informations sur la façon de classer les échantillons, elles devraient être intégrées dans la méthode Transcriptome

Les données A Genes (thousands) B C Different classes of experimental conditions, e. g. Cancer types, tissues, drug treatments, time survival, etc. Expression profile of all the genes for a experimental condition (array) Caractéristiques • La plupart des gènes sont non-informatifs pour le trait étudier • Le nombre de variables est plus important (plusieurs ordres de magnitude) que le nombre d’expériences Expression profile of a gene across the experimental conditions Experimental conditions tens up to no more than a few houndreds) (from Transcriptome

Classification : corrélations et distances • Corrélations : – Pearson : corrélation entre les valeurs – Sperman : corrélation de rangs (réduit l’effet des variations extrèmes) => Prend en compte les tendances • Spearman confidence (mesure de similarité) = 1 - pvalue • Distance euclidienne => différences entre coordonnées • Distance de manhattan (somme des différences absolues pour toutes les coordonnées du vecteur) => plus robuste Transcriptome

Classification hiérarchique • Arbre des gènes • Arbre des conditions Exemple : UPGMA Transcriptome Alizadeh et al. , Nature 2000

Classification nonhiérarchique • K-means : minimisation de la variance intra-classe (le nombre de classes est une instance) • ACP : rotation de la base maximisant les variances • SOM (Self Organising Maps) Transcriptome

Classification supervisée = « class prediction » • Quelques méthodes: – Bayes – Analyse discriminante linéaire – Les k plus proches voisins (k-NN) – Les arbres de classification (CART) Transcriptome

Autre type de puce analysant le transcriptome • Puces à exons : Analyse de l’épissage Transcriptome

Principe du CGH Transcriptome

Analyse des puces CGH Transcriptome

Objectifs de l’étude statistiques Transcriptome

Analyse de polymorphisme • • • Les Single Nucleotide Polymorphims (S. N. P) désignent des variations d'une seule paire de base du génome, entre individus d'une même espèce (e. g. 1/1000 paire de bases dans le génome humain). On parlera de formes alléliques synonymes dans le cas où plusieurs formes d'un SNP mènent à la même séquence polypeptidique, et de formes non-synonymes dans le cas où les séquences produites diffèrent. Les SNP qui se retrouvent dans des régions non-codantes peuvent avoir des conséquences sur l'épissage, les facteurs de transcription, ou sur les séquences d'ARN non-codant Transcriptome

Les SNP Une séquence d'ADN contenant un site SNP. Les allèles A et G sont illustrés. Une région chromosomique où seuls les SNP sont montrés. Trois haplotypes sont illustrés. Les deux SNP colorés suffisent à identifier (marquer) chacun des haplotypes. Par exemple, si les deux sites SNP marqueurs du chromosome portent les allèles A et Transcriptome T, on peut déduire qu'il s'agit du premier haplotype.

Puces SNP • Exemple : Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6. 0 1. 8 million markers for genetic variation • 900 000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) • 946, 000 probes for the detection of copy number variation Transcriptome

Ch. IP-on-Chip (étude des points de contacts entre une protéine et tout le génome) Transcriptome

Problématique biologique du TP • Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la majorité des pucerons. L’association est très ancienne (250 Ma). Les partenaires sont devenus dépendants. • Buchnera possède un génome de taille très réduite (400 à 600 kb), très riche en bases A et T et incluant de nombreuses mutations délétères (adaptatives ? ). -> Bon modèle d’étude à un niveau théorique (simple) -> très difficile à manipuler expérimentalement (incultivable) • Le génome de Buchnera est « dégénéré » -> Comment Buchnera régule-t-elle l’expression des ces gènes ? -> Comment Buchnera s’adapte-t-elle aux variations des besoins nutritionnels de l’hôte ? 64

La puce Buchnera 3ème oligo bloc (12 x 16) Oligo 3’ Oligo 5’ Doublets de spots Contrôles (+ et -) aiguille = 1 2 aiguille = 3 4 Superposition des 2 images (R et G) 65

Plan expérimental du TP • Approche comparative (non cinétique) – Expérience Naas (16 lames) : Milieu équilibré Milieu déséquilibré en AA riche en saccharose A B pauvre en sacharose C D 2 répétitions indépendantes de 8 lames : A/B, B/C, C/D, D/A, A/C, B/D, D/B, C/A A B D C -> Les données ont été acquises par N. Reymond (expérience naas. tri analysée en TP) 66