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INTRODUCCIÓN 1. Ley de Lambert-Beer 2. Determinación de proteínas 3. Manejo de micropipetas 1. 2. 3. 4. 5. Absorbancia 280 Biuret Lowry Bradford BCA

PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA Objetivos • Aplicar un método espectrofotométrico para estimar la concentración de una proteína. • Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros. • Construir curvas de calibración y comprender su importancia. • Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar.

ESPECTROFOTOMETRÍA • Definición: Medición de la cantidad de energía radiante que absorbe o transmite un sistema químico en solución en función de la longitud de onda de la radiación. • El espectrofotómetro: instrumento que permite relacionar la radiación absorbida o transmitida por las moléculas en solución con su concentración.

Espectrofotómetro

ESPECTROFOTÓMETRO

LEY DE LAMBERT Y BEER • Explica la relación entre la absorción de luz por una sustancia en solución, la concentración de ésta, y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. • A = Cl Donde: A = absorbancia; = Coeficiente de extinción molar; C = Concentración molar l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR • Medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración. Específico para cada sustancia. • Un compuesto con alto valor de ε es eficiente para absorber luz a una cierta l: puede detectarse al medir la absorción en soluciones muy diluidas.

Curva Patrón • Marco de referencia: se construye a partir de cantidades conocidas de una sustancia en solución: • p. ej. albúmina sérica bovina en agua Importante: Ajuste a cero en el espectrofotómetro con el medio líquido sin el analito (Blanco de la curva).

Limitaciones de L-B Linearidad limitada por factores químicos e instrumentales: • Desviación del ε a altas concentraciones (>0. 01 M) por interacciones electrostáticas • Difusión de la reflección por partículas suspendidas • Fluorescencia o fosforescencia de la muestra • Cambios en índice refractivo a altas concentraciones • Cambios en el equilibrio químico por alta concentración • Radiación no monocromática

% Absorbancia Limitaciones de L-B Concentración

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Comparación de métodos

Proteínas • Macromoléculas biológicas conformadas por una cadena lineal de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos con estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. • 20 aminoácidos diferentes en la cadena con propiedades diferentes cada uno de ellos.

Cuantificación de Proteínas • Técnica de rutina básica en el laboratorio: A) En la actividad específica de una preparación enzimática, B) Para diagnóstico de enfermedades, C) Cuantificación de proteínas recombinantes, etc.

Selección de método • Sensibilidad • Presencia de sustancias interferentes: la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. • Tiempo para el ensayo • Costo • Cantidad de proteína inicial

PROTEÍNAS y la absorción en la región UV • Bandas de absorción más significativas en ultravioleta cercano, entre 230 y 300 nm. • Aminoácidos aromáticos, además histidina y cistina. de • La cistina con pico de absorción en 250 nm.

REACCIÓN DE BIURET • La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos moléculas de urea (medio básico) (H 2 N-CO-NH 2). Complejo con Cu 2+ Baja sensibilidad del método

MÉTODO DE LOWRY • Reacción para determinar proteínas en dos pasos: 1. Reacción de Biuret. 2. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocaltau por grupos fenólicos de residuos de tirosina. El artículo de Oliver H. Lowry, Nira J. Rosenbrough, A. Lewis Farr, Rose J. Randall, “Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, ” The Journal of Biological Chemistry (JBC) 193: 265 -275, 1951, está considerado el artículo más citado de toda la historia de la ciencia

PRIMER PASO Enlaces peptídicos Reacción de Cu 2+ en medio alcalino SEGUNDO PASO tirosina, triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e histidina. Reacción con Folin-Cicalteau

LOWRY

Tinción de proteínas con Azul de Coomasie • Método de Bradford. • Gel de poliacrilamida- (SDS-PAGE) Bradford MM (May 1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding". Anal. Biochem. 72: 248– 54

BRADFORD v. Unión de Coomassie Blue G-250 (Serva Blue) a las proteínas. v. El colorante, en solución ácida, tiene dos formas: azul y naranja. v. Las proteínas se unen a la forma azul. El complejo proteína-colorante tiene un ε mayor que el colorante libre. v. Sensible (1 -15 mg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. v. Entre las interferencias están los detergentes y las soluciones básicas.

EL AZUL DE COOMASIE Y LOS AMINOÁCIDOS QUE RECONOCE

CAMBIO DE ABSORBANCIA DEL AZUL DE COOMASIE Coomasie libre (catiónico) Coomasie-proteína (aniónico) Libre Con proteína

BCA Smith, P. K. ; et al. (1985). "Measurement of protein using bicinchoninic acid". Anal. Biochem. 150 (1): 76– 85.

BCA 1. - Reacción de Biuret 2. - Péptidos con tres o más residuos de aa. forman complejo quelado con el cobre y tartrato de sodio. 3. - 2 BCA reaccionan con 1 Cu 1+. Desarrollo de color púrpura. Lectura a 562 nm. Formación de color influenciado por cisteína, cistina, tirosina y triptófano. A diferencia de métodos con Coomasie (Bradford), el esqueleto peptídico también contribuye a la formación de color, disminuyendo la variablidad.

Cuadro comparativo de sensibilidad de las técnicas de cuantificación de Proteínas

El experimento…

Absorbancia vs cantidad de materia Muestra µg BSA Abs. 750 nm 1 0 0 2 5 0. 165 3 10 0. 268 4 15 0. 418 5 20 0. 494 6 25 0. 581 7 30 0. 682 8 35 0. 789

Preguntas a entregar con diagrama de flujo 1. - ¿Qué debe ser es el blanco de la curva patrón? 2. - ¿Por qué es deseable construir una curva patrón de absorbancia en función de cantidad de materia en lugar de una curva de absorbancia en función de concentración?

Micropipetas

TIPOS DE MICROPIPETAS Los tipos: P 1000, P 200, y P 20. P 1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 μL P 200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 μL. P 20 es útil para volúmenes de 0. 5 hasta 20 μL. • No Trate de ajustar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del mínimo, esto descalibrará y dañará la micropipeta ($$$$$$). • Toda micropipeta utiliza puntas desechables. • No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan el polipropileno (ácidos, solventes). • No utilizar líquidos que emitan vapores. • La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C. • Al poner la punta, asegúrese que la punta sea del tipo correcto y que este correctamente ajustada. • Generalmente para P 1000 las puntas son azules, para P 200 son amarillas y para P 20 pueden ser amarillas o blancas.

Pipetas de repetición