Intitul De La Thse tudes Des Polysaccharides Issus

Intitulé De La Thèse : « Études Des Polysaccharides Issus D’Astragalus Gombo Bunge (Fabaceae) Récolté Au Sahara Septentrional Est Algérien : Activité Biologique »

ORIGINE ET PRINCIPAUX FRACTIONS DE SUCRE DES POLYSACCHARIDES

PROBLÉMATIQUE ? • • Question 01 : Polysaccharides : ? pourquoi travailler sur les polysacchari des L’importance des polysaccharides par rapport aux autres constituants (voir la part des polysaccharides par rapport aux autres constituants de la matière végétale sujet d’études) : • • • Nature ? (types de polysaccharides) • intérêt nutritionnelle ? Origines ? Quantité ? qualité ? Intérêt économique ? (part des polysaccharides au marché internationale)

Classification des sucres Sucres

Domaines d’utilisations des polysaccharides dans les différents industries - Industrie agro-alimentaire - Cosmétique, pharmacie, médecine - Autres industries : textile, papier, traitement des eaux

Les alginates : applications en industrie agro-alimentaire Glaces, crèmes glacées, sorbets: - contrôle de la formation de cristaux (au moment de la congélation) - révélateur de goûts - texture fine, onctueuse et unie bonne sensation en bouche Nappage pâtissier: gelée de fruits tartes et tartelettes aux fruits Entremets et desserts: fromages frais, crèmes fouettées, mousses parfumées, crèmes pâtissières, gâteaux de riz, … Stabilisateurs des émulsions de type huile-eau: assaisonnements et sauces (ketchup, mayonnaise, vinaigrette, …) Produits restructurés: à base de fruits, légumes, viandes et poisson (facile à manipuler mise en forme du produit final) divers: - clarification des huiles, du vinaigre, de la bière - lubrification des boyaux de charcuterie - enrobage du poisson congelé - stabilisation de produits liquides (jus de fruits, lait, …) Nourriture pour animaux (pour donner la forme des croquettes)

Les polysaccharides : autres applications industrielles Textile: alginates inertes par rapports aux colorants et aux fibres, utilisés pour l’impression (fixation des colorants et contrôle de leur migration) Papier: traitement de surface des papiers (coloration, glaçage, couchage des papiers de luxe) Traitements des eaux de surface: élimination des matières en suspension (coloration, turbidité) Enrobage des bâtons de soudure (protection du fil de métal contre l’oxydation) Autres: incorporation dans le latex, les peintures, les plâtres de moulure, les céramiques, les colles, les résines, les mines de crayon, certains produits horticoles, certaines bombes aérosols…

Les polysaccharides : applications en cosmétique, pharmacie, médecine Pharmacie/Cosmétique: masques (soins du visage), pâtes dentifrices, empreintes dentaires sirops, lotions, pommades (traitement brûlures et blessures), compresses, pansements, Médecine: biomatériaux, implants immunoisolés, drug delivery system

EXTRACTION , PURIFICATION ET IDENTIFICATION • Techniques d’Extraction et de purification ? (enzymatiques, physicochimiques) : • Choix de ou des techniques d’extraction (en fonction du polysaccharide visé par l’étude) • Optimisation de l’extraction (faire varier les conditions d’extraction) • Influences de la technique sur l’activité biologique • Conservation • Techniques d’Identification ?

Astragalus gombo Optimisation de l'extraction characterisation fonctionelle characterisation chimique (différents techniques et conditions d'extraction bioactivit ie in vitro methode s d'analys e Corrélation Extraction

Les alginates : procédés de production Principe : - acide alginique et sels correspondant insolubles - alginates de sodium ou de potassium solubles Étapes de production réactifs utilisés produits obtenus Algues brunes Broyage et déminéralisation Formol 5%, acide dilué Lixiviation H 2 SO 4 0, 2 N puis H 2 O Broyage et extraction alcaline Na 2 CO 3 4 % Filtration Précipitation Lavages/centrifugation Neutralisation Séchage et broyage HCl Acide alginique Alginate de sodium Acide alginique Sels alcalins de Na ou K Alginate de Na ou K Poudre

Techniques d’obtention des pectines

ACTIVITÉ BIOLOGIQUES ? quelles sont les activités biologiques des polysaccharides signalées par les scientifiques et quels types de polysaccharides dotés de ces activités (nature et composition)

JUSTIFIER LE CHOIX DE LA PLANTE ? Ø Pourquoi le genre Astragale ? v Botanique v origine Ø Importance ? • Disponibilité et répartition mondiale et en Algérie • Les espèces disponibles dans notre pays ? • Vertus ? : (recherches scientifiques effectuées) Médicine traditionnelle Pharmacologique ? Nutritionnelle ? Industrielle ?

Ø L’ESPÈCE : ASTRAGALUS GOMBO ? - Disponibilité et répartition en Algérie - Les recherches sur cette espèce ou d’autres espèces de même genre au niveau local et international ? - Quelle partie de l’espace que je dois choisir pour l’étude Racine ? Tige et feuilles ? Gousse ?

ACTIVITÉ BIOLOGIQUE ? • Travaux scientifiques • Mécanisme d’action • Expérimentation in vivo ou in vitro ? Sur quelle activité biologique des polysaccharides je dois travailler ?

Ø Disponibilité le du matériels et produits ? Ø Temps ?

INTRODUCTION • Les études sur l’activité biologique des polysaccharides extraites de plantes, champignons, levures, algues, lichens, et les animaux ont suscité beaucoup l’attention des scientifiques dans les dernières décades. En effet les polysaccharides ont été signalés à présenter une multitude d'activités biologiques (Chen, Zhang, Qu, et Xie, 2008; Silipo et al, 2005; . Wasser, 2002), une activité d’immunostimulation (Yamada, 1994; . Zha Luo, et Jiang, 2007), une activité antitumoral (Liu et al, 2007), des activités anti-oxydantes (Wang et Luo, 2007), anti-virale (Talarico et al. , 2005), un anticoagulant (Athukorala, Jung, Vasanthan, et Jeon, 2006), anticomplémentaire (Xu, Zhang, et Chen, 2007), anti-inflammatoire (Wu, Cui, Tang, Wang, et Gu, 2007), anti-ulcéreux (Ye, donc, Liu, Shin, et Cho, 2003), hypoglycémie (Tong, Liang, Wang et 2008), etc Toutes ces activités contribuent pour améliorer la fonction immunitaire du corps humain (Leung, Liu, Koon, & Fung, 2006; Zhang, Cui, Cheung, & Wang, 2007). •

• L’importance donnée par les scientifiques aux effets pharmacologiques bénéfiques des polysaccharides de genre Astragales notamment leurs propriétés anti-oxydantes (Chan et al. , 2009 ; Yuge et al. , 2011), immuno-modilatrices (Li et al. , 2009 ; Lu-Hang et al. , 2011), Activité anti tumoral et hépato protecteurs, (Kodera, et al. , 2006 ; Zhen-yuang et al. , 2011 ), anti inflammatoire (Choiet al. , 2007 ; Li et al. , 2009 ; Quing-yang et al. , 2011) ; et antifungique (Narasimha et al. , 2001) ont suscités notre attention à travailler sur une espèce de ce genre ; Astragalus gombo récoltée au Sahara septentrional Est Algerienne. • Le genre Astragalus de la famille des Fabacées comprend plus de 1500 espèces dont la plupart se répartissent en Orient. Une cinquantaine d’espèces sont retrouvées en Afrique du Nord et quinze environ au Sahara. La flore algérienne comprend plusieurs astragales dont Astragalus gombo. Cette espèce, n’a fait l’objet d’aucune étude phytochimique, du moins au niveau de l’Algérie.

• Méthodologie de travail • 1 - • 2 Composition biochimique globale de l’Astragalus gombo (pourquoi? ) • • Teneur en eau • • Dosage de la fraction protéique total. • • Dosages de la fraction lipidiques. • • Dosage de la fraction glucidique (dosage des oses totaux) • • Dosage de la fraction glucidique (cellulose, hémicelluloses, substance pectique, lignine) • • Fibre alimentaire total (soluble et insoluble). (methode de prosky et coll 1985) • • Principes d’étude : (justifier le choix de l’espèce, vertus, intérêt) Cendre et éléments minéraux

• 3 - Étude sur les polysaccharides issus de l’Astragalus gombo • - Extraction des polysaccharides • • Polysaccharides hydrosolubles • • Polysaccharides alcali-soluble • • Polysaccharides acido-solubles • - purification des extraits polysaccharidiques • - Composition des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles • - Détermination de la teneur en cendres totales • - dosage des éléments minéraux liés aux polysaccharides. • - Dosage des protéines liées aux polysaccharides (glycoprotéine) • - Dosages des oses neutres et des oses acides • - Caractérisation des polysaccharides • - Caractérisation des résidus glycosidiques. • - Hydrolyse des liaisons glycosidiques. • - degré de polymérisation des polysaccharides.

• Bio activité des hydrolysats de polysaccharides. • - Activité pré biotique (choix des souches) • - Activité anti-oxydante • - Anti-inflammatoire (expérimentation soit in vitro ou in vivo) • - Activité anti coagulante (expérimentation soit in vitro ou in vivo) • - Activité immuno-modalitrice (expérimentation soit in vitro ou in vivo) • - Activité anti hypertensive

• A : Généralité sur le genre Astragalus • Historique : • • Description botanique • Famille: Légumineuses ou Papilionacées (aujourd'hui, Fabacées) Une quinzaine d'espèces d'astragales au Sahara, pas toujours faciles à identifier au premier coup d'oeil. . . Astragalus gombo est une plante vigoureuse aux grandes fleurs jaune d'or en grappes serrées. Ses longues feuilles dressées sont composées de multiples petites folioles ovales. Même si il préfère les fonds d'oueds, il s'aventure sans hésiter dans les ergs où il peut constituer des touffes imposantes dans les dépressions entre les dunes. • Principales astragales répertoriées en Algerie:

Intérêt médicales de la plante : • L’Astragale est une plante médicinale d’excellence, les parties de la plante utilisées sont les racines, cette plante vu son importance a été soumise à des recherche intenses en botanique et en pharmacologie • L’Astragale contient de nombreux élément actifs, tel que des flavonoïdes, des polysaccharides, des glycosides tri terpènes, des acides aminés et des traces de minéraux. • Les recherches sur les polysaccharides Astragales ont montré que ces derniers sont dotés de plusieurs vertus thérapeutiques et protectrices : • Activité anti tumoral (rétablir le niveau normal des cellules T) • Effet protecteur des cellules hépatiques (soumises à certain toxiques) • Effet anti inflammatoire • Effet antioxydants • • Les astragales sont recommandée dans les cas de : faiblesse, engourdissements, asthme, nervosité, tendance aux infections, transpiration nocturnes, rhumes, et grippes, douleurs arthritiques, déficiences du système immunitaire et insuffisance rénale. • • Toxicité des astragales ?

• Quelques travaux effectués sur l’activité biologique des polysaccharides issus des astragales 1 - Activité anti-oxydante (anti-peroxydation des lipides) • Chan , J. Y. W. . LAM. F. c. , Leung, , P. C. , Che. C. T. , & Zhang , X. (2009). Antihyperglycemic and antioxydative effects of a herbal formulation of Radix Astragalis Radix Codonopsis and cortex lycii in a mouse model of type 2 diabetes mellitus. Phytotherapy Research, 23, (5), 658 -665. • yuge Niu, Hengyu Wang, Zhuohong Xie, Monica Whent, Xiangdong Gao, Xian Zhang , Shan Zou, W (2011). Structural analysis and bioactivity of a polysaccharide from the roots of Astragalus membranaceus (Fisch) Bge. var. monolicus(bge)Hsiao. Food Chemistery, 128, 620 -626. • • Yuang Wang, Fangfang Mao, Xinlin wei. , (2012). Characterisation and antioxidant activities of polysaccharides from leaves, flowers and seeds of green tea. Carbohydrate polymers, 88, 146153.

2 - Activité immuno-modalitrice (immunité spécifique et non spécifique) • Li Rui, Chen Wei-Chang , Wang Wei-peng, Tian. Wen-yan, Zhang Xue-guang. (2009). • Extraction, characterisation of Astragalus polysaccharides and its immune modulating activities in rats with cancer. Carbohydrate Polymers, 78, 738 -742. • Lu-Hang Zhao, Zhi-Xin Ma, Jie Zhu, Xiao-Hong Yu, Deng-Po Weng, (2011). Characterisation of polysaccharide from astragalus radix as the macrophage stimulators. Cellular Immunology, 271, 323 -334.

3 - Activité anti tumoral (rétablir le niveau normal des cellules T) • Zhen-yuang Zhu, Rong-qiang Liu, Chuan-ling Si, Fang Zhou, Yun-Xia Wang (2011). Structural analysis and anti –tumor activity comparison of polysaccharides from astragalus. Carbohydrate Polymers 85, 895 -902 • Combinaison de plusieurs méthodes thérapeutique dans le but d’améliorer les traitements du cancer gastrique et minimiser leurs symptômes. (Kodera, Fujiwara, Koike, & Nakao, 2006)

4 - Effet anti inflammatoire : • Choi, S. I, . Heo, T. R. , Min, B, H. , Cui, J. H. , Choi, B. H. , & Park, S. R. (2007). Allevation of osteoarthritis by calycosin -7 -O-beta-D-glucopyranoside (CG) isolated from Astragali Radix (AR)in rabbit osteoarthris (OA) model. Osteoarthris and Cartilage, 15(9), 1086 -1092. • Li Rui, Chen Wei-Chang , Wang Wei-peng, Tian. Wen-yan, Zhang Xue-guang. Optimisation of extraction technology of astragalus polysaccharides by response surface methodology and its effect on CD 40 (Protein). Carbohydrate Polymers 78(2009) 784 -788. • Quing-yang liu, Yong-ming Yao, Shu-wen Zhang, Zhi-yong Sheng, (2011). Astragalus polysaccharides regulate T cell-mediated immunity via CD 11 chigh CD 45 RBlow DCs in vitro. Journal of Ethnopharmacology 136 , 457464.

• Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui font partie du système réticulohistiocytaire, cellules présentatrices d'antigènes et qui présentent dans certaines conditions, comme leur nom l'indique, des dendrites (des prolongements cytoplasmiques). Les cellules dendritiques ont deux fonctions principales : • le déclenchement de la réponse immunitaire adaptative, dont les acteurs principaux sont les lymphocytes T et les lymphocytes B, dirigée contre des antigènes du « non-soi » ; • le maintien de la tolérance centrale au « soi » dans le thymus, par le processus impliquant les lymphocytes T dit de sélection négative. • Elles résident dans les tissus à l’état immature et ont une morphologie très variée. On peut citer parmi elles cellules de Langerhans.

5 - Effet antifungique : • Narasimha Kumar Kopparapu, Zhuqing liu, Fan Fei, Qiaojuan Yan, Zhengqiang Jiang. Purification and characterisation of a chitinase (s. AMC) with antifungal activity from seeds of Astragalus membranaceus. Process Biochemistery 46(2001)1370 -1374

• Activité anti coagulante (inhibition de l’agrégation des plaquettes) • Activité anti hypertensive • Activité pré biotique • Effet protecteur des cellules hépatiques (soumises à certain toxiques)

• Méthodes de dosage des polysaccharides • 1 -1 Dosage des polysaccharides non amylacés (ANP) • 1. 1. 1 Purification des ANP selon Melthon et Smith • Ce protocole décrit une procédure d’isolement des parois cellulaire végétales contenant peu ou pas d’amidon à l’aide de tampon phénol-HEPES • Principe : • Une série d’étapes permettant de casser puis d’ouvrir les cellules afin de nettoyer les composées cytoplasmiques. • Les eaux de lavage sont récupérés afin d’y déterminer la composition des polysaccharides parois cellulaire soluble. • Le but de ce procédé est d’obtenir une préparation de parois cellulaires exemptes de composés cytoplasmiques (membranes, matériel nucléaires, enzymes et amidon)

Méthodes de dosage des polysaccharides • 1 -1 Dosage des polysaccharides non amylacés (ANP) • 1. 1. 1 Purification des ANP selon Melthon et Smith • Ce protocole décrit une procédure d’isolement des parois cellulaire végétales contenant peu ou pas d’amidon à l’aide de tampon phénol-HEPES • Principe : • Une série d’étapes permettant de casser puis d’ouvrir les cellules afin de nettoyer les composées cytoplasmiques. • Les eaux de lavage sont récupérés afin d’y déterminer la composition des polysaccharides parois cellulaire soluble. • Le but de ce procédé est d’obtenir une préparation de parois cellulaires exemptes de composés cytoplasmiques (membranes, matériel nucléaires, enzymes et amidon)

• L'HEPES (ou acide 4 -(2 -hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) est un composé organique zwitterionique, couramment utilisé sous forme de solution tampon en biochimie. Il est largement préféré au tampon bicarbonate pour la culture cellulaire en raison d'une meilleure stabilité au p. H physiologique. • Contrairement aux tampons phosphates et bicarbonates, la dissociation de l'HEPES dans l'eau diminue lorsque la température diminue aussi, ce qui privilégie son utilisation comme solution tampon pour maintenir la structure et la fonction d'enzymes à basse température. • 1. 1 homogénéisation des parois cellulaire végétales

• 1. 1. 1. 2 fractionnement des polysaccharides contenus dans les parois cellulaire • 1. 1. 2 • principe : la composition en monosaccharides neutre des parois cellulaires peut être déterminée après hydrolyse des polysaccharides avec des acides forts et après réduction des monosaccharides issus de l’hydrolyse avec du brohydrure de sodium en composés d’acétate d’alditol. Les hydroxyles de chaque alditol subiront une acétylation. • L’acétate d’alditol obtenu est volatil et peut être identifié par CPG • Plusieurs procédures peuvent être utilisées pour hydrolyser les polysaccharides dans les fractions des parois cellulaires. Par exemple, les polysacchartides non cellulosiques peuvent etre hydrolysés en utilsant l’acide sulfurique 1 M pendant 2 à 3 h à 100 0 C. • Une des procédures utilisées est celle d’Albersheim et al. Qui consiste à incuber les fractions des parois cellulaires dans l’acide trifluoroacétique (TFA). 2 M à 121 0 C pendant 1 h. l’avantage du TFA est d’obtenir une hydrolyse rapide et d’éliminer l’acide par évaporation. dosage des ANP par dosage des sucres neutres sous forme d’acétates d’alditols en CPG

• 1. 1. 3 dosage des glucosaminoglycanes par HPLC échangeuse d’anions après hydrolyse acide. • 1. 1. 4 Dosage des acides uroniques des polysaccharides par HPLC échangeuse d’anions après hydrolyse acide. • 1. 1. 5 Détermination du degré de polymérisation (DP) • Le degré de polymérisation peut être calculé par détermination de la masse molaire du polysaccharide. • Différentes méthodes peuvent être appliquées : • - Chromatographie en perméation de gel, détection RI ou diffusion de lumière ; • - Spectromètre de masse • - Chromatographie échangeuses d’ions.