Instrumentls metodes bioij Elektroforze 2013 2014 mcbu gada

Instrumentālās metodes bioģijā. Elektroforēze 2013. /2014. mācību gada 1. semestris 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 1

$Literatūra • Lekciju materiāli - \PriedeGrozsMikrobiologijas MarisInstr. Met • Westermeier R. Electrophoresis in Practice;$

Literatūra • Lekciju materiāli - \PriedeGrozsMikrobiologijas MarisInstr. Met • Westermeier R. Electrophoresis in Practice; 1997, Wiley-VCH, Germany 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 2

Literatūra Laboratorijas metožu krājumi. Piemēram, • Maniatis et al. , Molecular Cloning. 1982, CSH • Short Protocols in Molecular Biology. Ed. in Chief Ausubel, F. , 1995, Wiley 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 3

Literatūra Tiek izdots žurnāls Electrophoresis 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 4

Elektroforēze Nozīmīga boķīmijas metode, lai raksturotu: - pētāmās makromolekulas - lādiņu, molekulmasu, telpisko apveidu; - to tīrību, - homogenitāti. Visbiežāk izmanto makromolekulu molekulmasas noteikšanai. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 5

Elektroforēze 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 6

Elektroforēzes pamatā ir lādētu daļiņu pārvietošanās elektriskajā laukā. + + + Katods 11. 10. 2013. Anods Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 7

Elektroforēze Visplašāk izmanto: - NS un - proteīnu raksturošanai. Šīm molekulām viegli piemeklēt vides apstākļus, kuros tām būtu pietiekami liels lādiņš. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 8

Elektroforēze - potenciālu starpība starp elektrodiem (V) l – attālums starp elektrodiem l + +q E – elektriskā lauka intensitāte (stiprums) = /l (V/cm) F = Eq 11. 10. 2013. F=ma a=F/m=Eq/m Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 9

Elektroforēze Ja tas notiktu vakumā, lādētās molekulas paātrinātos un ātri sasniegtu elektrodus. Vidē, kurā parasti veic elektroforezi, - viskozitātes dēļ, - starp molekulām notiekošo sadursmju dēļ 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 10

Elektroforēze daļiņu kustība ir apgrūtināta, - tā notiek lēnāk, - ir vairāk atkarīga no - daļiņas lieluma un - ģeometriskās formas. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 11

Elektroforēze Sfēriskas daļiņa viskozā vidē: Fb Fb=6 r v v=Fb/6 r r - rādiuss - šķīduma viskozitāte v – daļiņas kustības ātrums. + Fe v = Eq/6 r 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 12

Elektroforēze Sfēriskas daļiņas viskozā vidē: Daļiņu pārvietošanās ātrums ir - tieši proporcionāls - elektriskā lauka stiprumam un - daļņas lādiņam - apgriezti proporcionāls - daļiņas izmēram un - vides. Mikrobioloģijas viskozitātei. 11. 10. 2013. un biotehnoloģijas katedra ML v = Eq/6 r 13

Elektroforēze Sfēriskas daļiņa viskozā vidē: v = Eq/6 r Tā kā molekulas viena no otras atšķiras ar savu - lādiņu un - izmēriem, tad pēc noteikta laika elektriskā lauka iedarbībā tās būs veikušas atšķirīgus attālumus. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 14

Elektroforēze Šie vienādojumi labi apraksta molekulu pārvietošanos viskozā cukuru šķīdumā, bet nav viennozīmīgi attiecināmi uz ierobežojošo gelelektroforezi. Šeit papildus notiek gela struktūras un molekulu mijiedarbības. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 15

Elektroforēze Daļiņu kustības trajektorijas spēka līnijas potenciālu izolīnijas Daļiņas pārvietosies pa spēka līnijām. Tās ir perpendikulāras potenciāla izolīnijām. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 16

Elektroforēze Lai iegūtu labu paraugu sadalījumu, nepieciešamas elektriskais lauks ar paralēlām spēka līnijām 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 17

Elektroforēze v = Eq/6 r Lai precīzāk raksturotu daļiņu, neatkarīgi no pieliktā elektriskā lauka intensitātes, ieviests lielums Relatīvā elektroforētiskā mobilitāte - µ = v/E = q/6 r 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 18

Elektroforēze Barošanas avoti Ja ir atbilstošs barošanas bloks var lietot Oma likumu I=U/R Pretējā gadījumā spēkā ir Oma likums slēgtai ķēdei. E= /l kameras 11. 10. 2013. Ugelam=E*lgelam Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 19

Elektroforēze Īpatnējā elektriskā pretestība (ro) ( *m) [ I=U/R] R= l/S Atkarīga no: - elektroforezes vides, - temperatūras, - notiekošajiem elektroķīmiskajiem procesiem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 20

Elektroforēze Temperatūra atkarīga no jaudas un siltuma apmaiņas (dzesēšanas) P=I*U Ja U ir konstants, jāseko arī I, jo - nevienmērīgi sasilusi vai - pārkarsusi vide 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 21

Elektroforēze Temperatūra rada - smaidīšanas efektu, - var bojāt elektroforēzes vidi un gelu, - denaturēt, pārveidot pētāmās molekulas. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 22

Elektroforēze Barošanas avoti regulējas pēc U, I, P, (t°) Elektrisko lauku rada pieliktā potenciālu starpība vai spriegums. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 23

Elektroforēze U izvēle pēc attāluma starp elektrodiem. parasti E = 5 - 10 V/cm I limits – lai būtiski nepalielinās temperatūra Var izmantot - labu dzesēšanu - mazu gela / bufera slāņa šķērsgriezuma laukumu, - mazu bufera jonu spēku (liela pretestība). 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 24

Elektroforēze Bufera jonu spēku var samazināt, kamēr to pieļauj buferējošā kapacitāte. Elektrolīzs laikā mainās H+ jonu koncentrācija. Anods H 2 O – 2 e => 2 H+ + O 0 11. 10. 2013. Katods 2 H 2 O +2 e => 2 OH- + 2 H 0 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 25

Elektroforēzes vēsture + Pirmās elektroforēzes tika veiktas U veida caurulēs, cukuru šķīdumos. Pētāmo vielu sadalījuma atšifrēšana bija sarežģīta un sadalījums nestabils. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 26

Elektroforēzes vēsture Metodi 1937. gadā ieviesa zviedru ķīmiķis Arne Tiselius. (1902 - 1971) Panākumi tika atzinīgi novērtēti. 1948. gadā saņem Nobela prēmiju. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 27

Elektroforēzes vēsture Lai būtu vieglāk saglabāt vielu sadalījumu, sāka lietot nesējus: - papīru un - cietes gelus. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 28

Elektroforēzes vēsture Taču arī šie nesēji deva diezgan nekvalitatīvu ainu. Vēlāk izrādījās ka labākie nesēji ir: - agarozes un - poliakrilamīda geli. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 29

Elektroforēzes vēsture Brīvās plūsmas elektroforēze (FFE) (1982) Preparatīva metode. Ļauj frakcionēt ne tikai - molekulas, bet arī - organellas no audu homogenizātiem, - noteiktas šūnas. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 30

FFE Brīvās plūsmas elektroforēze (1982) Bufera plūsma Pa 0, 5 – 1 mm platu spraugu starp dzesējamām stikla platēm, perpendikulāri elektriskajam laukam plūst buferšķīdums. Otrā galā tas tiek savākts vairākos stobriņos. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 31

FFE Brīvās plūsmas elektroforēze (FFE) (1982) 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 32

FFE Pro. Met. HEUS FFE™ sistēma 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 33

FFE OCTOPUS FFE sistēma 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 34

Elektroforezes vēsture Micelārā elektrokinētiskā hromatogrāfija - MEKC (1984) Apvienotas HPLC un CE labākās īpašības, līdz ar to var labi sadalīt gan lādētas daļiņas gan daļiņas bez lādiņa. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 35

Elektroforēze nesējos 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 36

Elektroforēze nesējos Pēc molekulu sadalīšanās principa izšķir: - zonālā elektroforēze, - izotaho elektroforēze, - izoelektriskā fokusēšana. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 37

Elektroforēze nesējos Zonālā Katra veida molekulas “nes” bedrītes attēlu. p. H konstants vide - bufersistēma + nesējs 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 38

Elektroforēze nesējos Zonālā 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 39

Elektroforēze nesējos Izotahoforeze Pārtraukta buferu sistēma + nesējs => ir vadošie joni ar lielu mobilitāti, un terminējošie joni ar mazāku mobilitāti nekā analizējamajām molekulām. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 40

Elektroforēze nesējos Izotahoforeze Starp abiem buferiem uznes paraugu. Visu forezes laiku paraugs paliek uz robežas starp abām vidēm. Visas parauga sastāvdaļas pārvietojas kopā, bet sakārtojas atbilstoši lādiņam vai molekulu izmēram. Notiek zonu sakoncentrēšanās. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML T T V V 41

Elektroforēze nesējos Izoelektriskā fokusēšana (IEF) ir elektroforeze p. H gradientā, kas izveidots starp katodu un anodu. p. H gradients 10 7 3 Vides p. H stabilizē amfolīti vai imobilīni 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 42

IEF Pie p. H vērtībām, kuras mazākas par proteīna p. I vērtību, to molekulas ir lādētas pozitīvi, bet pie p. H vērtībām, kuras lielākas par proteīna p. I vērtību, to molekulas lādētas negatīvi. p. I=8 11. 10. 2013. + p. H=7 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML p. I=6 43

IEF Ja p. I=p. H, proteīna molekula zaudē lādiņu un uz elektrisko lauku vairs nereaģē. p. I=7 11. 10. 2013. p. H=7 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML p. I=7 44

Nesēji elektroforēzei Retāk tiek izmantots - papīrs un - plānā slāņa nesēji. Tajos 11. 10. 2013. - sadalīšana notiek sliktāk un - uznesamā parauga tilpums ir ierobežots. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 45

Nesēji elektroforēzei Papīru un plānā slāņa nesējus izmanto lielmolekulāru - polisaharīdu un - lipopolisaharīdu analīzēm, Jo tie viegli aizsprosto hidrofīlo gelu poras. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 46

Nesēji elektroforēzei Celulozes acetāta membrānas mēdz lietot klīniskajā praksē. Piemēram, seruma proteīnu analīzē. Ar tām darbošanās ir vienkāršāka, taču iegūtās zonas ir stipri difūzas un ļauj spriest tikai par galvenajiem parauga komponentiem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 47

Nesēji elektroforēzei Ideāls materiāls nesējam: - vienāds, stingri noteikts poru izmērs, - ķīmiski inerts, - ar ierobežotu elektroosmozi, - mehaniski izturīgs. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 48

Cietes gels (1955) Gatavo no daļēji hidrolizētas kartupeļu cietes, - 5 – 10 mm biezs, - poru izmēru nosaka cietes koncentrācija. - Rezultātiem slikta atkārtojamība; - ar gelu grūti apieties mehāniskās neizturības dēļ. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 49

Cietes gels (1955) Joprojām nedaudz izmanto - izoenzīmu pētījumos un - klīniskajā diagnostikā. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 50

Agarozes gels Agaroze Polisaharīds, ko iegūst no brūnaļģēm. Labi jāattīra no agaropektīna. No šīs tīrības pakāpes ir atkarīga gela elektroosmotiskā vērtība. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 51

Agarozes gels Agaroze Vēl agarozi raksturo gela kušanas temperatūra (35 – 95°C), kas atkarīga no agarozes molekulu izmēra. Veido samērā lielas poras. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 52

Agarozes gels Lieto 2 -0, 5% gelus. 1% gelā poru izmērs ~ 150 nm. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 53

PAAG Poliakrilamīda gels (PAAG) (1959) Ķīmiski inerts un mehāniski samērā izturīgs. Tiek veidots polimerizējot - akrilamīda monomērus lineāros pavedienos, kuri - tiek sasaistīti šķērseniski ar N, N’-metilēnbisakrilamīda molekulām. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 54

PAAG Akrilamīds 11. 10. 2013. Metilēn-bisakrilamīds Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 55

PAAG Veidojas dzidri caurspīdīgs gels ar mazu endoosmozi. Poru izmēru gelā var labi regulēt ar kopējo AA koncentrāciju (T) un šķērssaistības pakāpi (C). T% = (a+b)100/V C% = (b)100/(a+b) , kur a - akrilamīds (AA); b - bis-akrilamīds (gramos); V -tilpums (ml). 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 56

PAAG Ja C% - konstants T% pieaugot, poru izmēri gelā samazinās Ja T% - konstants C% pieaugot, poru izmēri vismazākie pie C = 4%. Abos virzienos no šī punkta poru izmēri palielinās. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 57

PAAG C > 5% lieto specifiskos gadījumos, jo šādos apstākļos gels kļūst hidrofobs - nav piemērots hidrofīlu savienojumu analīzei, - grūti savietojams ar ūdens šķīdumu buferiem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 58

PAAG Gela polimerizēšanos kavē O 2, oksidējot brīvos radikālus, kuri nepieciešami polimerizācijas reakcijas norisei. Lai to novērstu, gela šķīdumu - atgaiso, - samazina tā brīvo virsmu - gelu lej starp stikliem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 59

PAAG Polimerizācija ir atkarīga no temperatūras, - ātrai un pilnīgai gela polimerizācijai vēlamā t° 20°C un vairāk. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 60

Gelektroforēzes veidi Pēc molekulu mijiedarbības ar nesēju izšķir: - neierobežojošā (ne restriktīvā) elektroforēze, - ierobežojošā (restriktīvā) elektroforēze. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 61

Gelektroforēzes veidi Neierobežojošā (ne restriktīvā) Analizējamo molekulu izmēri, salīdzinājumā ar gela porām ir mazi. + + Gela materiāla ierobežojošā darbība izpaužas vāji. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 62

Gelektroforēzes veidi Neierobežojošā (ne restriktīvā) Daļiņu pārvietošanās ātrums pamatā atkarīgs no to lādiņa, mijiedarbības ar buferšķīdumu. Ar gela materiāla palīdzību difūzija tiek ierobežota vāji un zonas ir stipri izplūdušas. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 63

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Zonālā Agarozē sadala enzīmus un citus proteīnus. Lieto 1 – 0, 7% agarozi. Seruma proteīnu vai izoenzīmu (laktātdehidrogenāze, kreatīnkināze) klīniskām analīzēm. Veicama īsā laikā - ap 30 min. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 64

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Zonālā Detektēšanā var lietot: imunofiksāciju - specifiskas antivielas viegli iekļūst gelā, precipitējot antigēnos proteīnus, pārējos proteīnus no gela var viegli izmazgāt. Pēc tam veic proteīnu iekrāsošanu. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 65

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Zonālā Detektēšanā var lietot: imunoprintingu - uz gela tiek uzliks ar specifiskajām antivielām piesūcināts materiāls. Antigēnās molekulas difundē uz uzlikto materiālu, ar atbilstošajiem antigēniem veidojot imunoprecipitātu zonas. Lieto geliem ar mazām porām un mazām antigēnu molekulām. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas 66 katedra ML

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze Parasti tiek izmantota precipitātu veidošanās antigēna un antivielas ekvivalences punktā. precipitācija 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 67

Imunoprecipitācija Precipitācija antigēna un antivielas ekvivalences punktā. precipitācijas zona http: //web. campbell. edu/faculty/mlsuhan-thomas/biol 335/lec-02 -13 -antibody-ch 6. html 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 68

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze Pretplūsmu Bufera un gela videi p. H 8, 6 , pie kura antivielām nav lādiņa, tās nes elektroosmozes plūsma. Vairums paraugā esošo molekulu pārvietojas pretējā virzienā, elektriskā lauka iespaidā. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 69

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze Pretplūsmu Varētu teikt - imunodifūzijas paātrināts variants. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 70

Imunodifūzija Partastā imunodifūzija - agarozes slānī izveidotas iedobes; - vidū iepildītas antivielas; - apkārt paraugi, kuros tiek meklēti atbilstošie antigēni. Ja paraugs satur meklētos antigēnus, veidojas precipitācijas josla. Partastā imunodifūzijas testa veikšana ilgst 12 -48 stundas. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 71

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze Pretplūsmu Av antivielas 11. 10. 2013. ( ( parauga proteīni Ag Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 72

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze “Raķešu” p. H 8, 6 antivielas pievienotas gelam, antigēni pārvietojas, kamēr tiek sasniegts ekvivalences punkts. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 73

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze “Raķešu” "Stabu" garums proporcionāls specifiskā antigēna koncentrācijai vai imunoreaktivitātei. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 74

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze/imunodifūzija a) Parauga molekulas elektroforētiski sadala atbilstši molekulu izmēriem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 75

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze/imunodifūzija b) Iepilda atbilstošās antivielas. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 76

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Imunoelektroforēze/imunodifūzija c) 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 77

Neierobežojošā gelektroforēze AGAROZE - Afīnā Līdzīgi kā imunoelektroforēze, tikai antivielu vietā citi komponenti ar lielu afinitāti pret pētāmo molekulu. Piemēram, 11. 10. 2013. lektīns – glikoproteīns, enzīms-substrāts, enzīms-specifisks inhibitors. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 78

Neierobežojošā gelektroforēze PAAG - Zonālā Analizē peptīdus un polifenolus. Mw ap 500 Da un mazāk. PAAG uz cieta pamata. Pēc elektroforezes ātri izžāvē (~100 °C) un krāso. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 79

Ierobežojošā gelektroforēze Ierobežojošā (restriktīvā) Gela poras samērojamas ar pētamo molekulu lielumu un kavē to pārvietošanos elektriskajā laukā + + + Tiek traucēta arī patvaļīga difūzija. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML + 80

Ierobežojošā gelektroforēze Zonas iznāk asākas, molekulu pārvietošanās atkarīga ne tikai no lādiņa, būtisku lomu spēlē to izmēri (molekulmasa) kā arī ģeometriskā forma - jo lielāka molekula, jo tai grūtāk pārvietoties caur gela porām. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 81

Ierobežojošā gelektroforēze AGAROZE Gela poras ir lielas. Tikai īpaši lielu proteīnu vai proteīnu kompleksu sadalīšanai. Plaši lietota NS, īpaši DNS (0, 5 – 23 kb) analīzei. “Nusive” agaroze, ar zemu elektroosmozi - arī īsākiem DNS fragmentiem 1 kb līdz 0, 1 kb. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 82

Ierobežojošā gelektroforēze AGAROZE Piemērotākā agarozes koncentrācija dažāda lieluma DNS fragmentu analīzei. Agarozes koncetrācija (%) 0, 6 0, 7 0, 9 11. 10. 2013. DNS fragmentu lielums (kb) 20 - 1 1, 2 10 – 0, 8 7 – 0, 5 Agarozes DNS fragmentu koncetrācija. lielums (%) (kb) 1, 2 1, 5 2, 0 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 6 – 0, 4 4 – 0, 2 3 – 0, 1 83

Ierobežojošā gelektroforēze AGAROZE Marķējošās krāsvielas DNS analīzei. Ksilēncianols Bromofenolzilais kā kā 5 kb, 0, 3 kb DNS fragmenti > 23 Kb agarozē pārvietojas vienādi un tos var atdalīt tikai ar => 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 84

Ierobežojošā gelektroforēze Pulsējošā lauka elektroforēzi. Fragmentiem līdz 10 Mb Pa diagonāli mainās elektriskā lauka virziens. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 85

Ierobežojošā gelektroforēze Pulsējošā lauka elektroforēzi. Tā rezultātā DNS molekulas spiestas ritmiski mainīt savu kustības orientāciju kā arī izstiepties un sarauties. Šis telpiskās strukturas un novietojuma izmaiņu laiks ir atkarīgs no molekulas izmēriem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 86

Ierobežojošā gelektroforēze Var izdalīt: - natīvo - denaturējošo 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 87

Ierobežojošā gelektroforēze Natīvā elektroforēze: pētāmās molekulas tiek saglabātas pēc iespējas tādā veidā, kādā tās atrodas in vivo. elektroforēzes buferī, paraugu sagatavošanas gaitā izmanto savienojumus un apstākļus, kuri pēc iespējas mazāk varētu ietekmēt analizējamās molekulas. molekulu kustīgumu būtiski ietekmē to telpiskā forma. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas 88 katedra ML

Ierobežojošā gelektroforēze Denaturējošā elektroforēze: pētāmās molekulas tiek noteiktā veidā denaturētas. elektroforēzes buferī un paraugu sagatavošanas gaitā izmanto denaturējošus savienojumus un apstākļus. molekulu kustība labāk atbilst to masai. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 89

Ierobežojošā gelektroforēze Denaturējošā elektroforēze: Proteīnu analīzē biežāk izmanto denaturējošos aģentus: - SDS (nātrija dodecil- vai lauril- sulfātu), - paraugu apstrādē arī merkaptoetanolu. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 90

Ierobežojošā gelektroforēze Denaturējošā elektroforēze: Nukleīnskābju analīzē biežāk izmanto denaturējošos aģentus: - urīnvielu, - formamīdu, - paaugstinātua t° (50 - 80 °C, atkarībā no citu denaturējošo aģentu koncentrācijas vidē). 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 91

Ierobežojošā gelektroforēze Disc elektroforēze (discontinuous) pārtrauktā elektroforēze (1964) Parasti lieto proteīniem. Šajā metodē novērsta proteīnu tendence “salipt” (nekovolentās molekulu mijiedarbības), kas traucē kvalitatīvu elektroforēzi smalkporainā gelā. Izmanto divus apvienotus PAA gelus. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 92

Ierobežojošā gelektroforēze Disc elektroforēze (discontinuous) pārtrauktā elektroforēze (1964) Koncentrējošais gels - ar lielām porām un p. H 6, 8 sadalošais gels - ar mazām porām, p. H 8, 8. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 93

Ierobežojošā gelektroforēze Disc elektroforēze (discontinuous) pārtrauktā elektroforēze (1964) Anjoni: vadošie ar lielu mobilitāti Clterminējošie ar mazu mobilitāti Gly- vai Ala– labi šķīstoši, mazi un nesaistās ar proteīniem. Koncentrējošajā gelā, p. H dēļ, Gly- vai Ala- joniem mazs lādiņš. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 94

Ierobežojošā gelektroforēze Disc elektroforēze (discontinuous) pārtrauktā elektroforēze (1964) Koncentrējošajā gelā notiek izotahoforēze – proteīni sakārtojas to mobilitātes secībā, bet paliek kopā, atrodas robežzonā starp glicīna (alanīna) un Cl- joniem, individuālās zonas sakoncentrējas. Lielo poru dēļ kustīgumu nosaka tikai lādiņš. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 95

Ierobežojošā gelektroforēze Disc elektroforēze (discontinuous) pārtrauktā elektroforēze (1964) Nonākot pie sadalošā gela robežas, proteīnu iekļūšana tajā ir apgrūtināta, kas nav attiecinams uz glicīnu. Gly- (Ala -) apsteidz proteīnus, jo sārmainajā vidē to lādiņš jūtami pieaug. Tie pārvietojas kopā ar pašiem mazākajiem proteīniem. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 96

Ierobežojošā gelektroforēze Disc elektroforēze (discontinuous) pārtrauktā elektroforēze (1964) Proteīni sāk sadalīties pēc zonālās elektroforēzes principa. Proteīni ar p. I > 6, 8 pārvietojas katoda virzienā un tiek zaudēti. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 97

Ierobežojošā gelektroforēze Denaturējošā (SDS) disc elektroforēze (1967) Proteīni tiek sadalīti tikai pēc Mw, jo - telpiskā struktūra noārdīta, - multimēri izjaukti, - visiem liels negatīvs lādiņš (SDS) – kustas ātrāk un visi vienā virzienā. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 98

Ierobežojošā gelektroforēze • Denaturējošā (SDS) disc elektroforēze (1967) Labāk krāsojas (tikai jāatmazgā SDS) Pirms uznešanas visi proteīni tiek izšķīdināti - sārmainā vidē ar jonisko deterģentu, tiek pievienots arī merkaptoetanols, kurš nodrošina S-S tiltiņu noārdīšanu. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 99

Ierobežojošā gelektroforēze Kapilārā elektroforēze (CE) (1981) Stikla kapilārs – 20 – 30 cm garšs, 0. 1 -0, 05 mm diametrā, laba temperatūras apmaiņa ar vidi (labi dzesējas). Var izmantot E = 1 k. V/cm. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 100

CE Kapilārā elektroforēze (CE) (1981) - ekonomiska - gelā ievada 0, 004 µl parauga, - ilgst 10 – 20 min. Pilnībā automatizējama – gan paraugu uznešana gan rezultātu nolasīšana, un frakciju kolekcionēšana. 11. 10. 2013. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 101