INMUNOHEMATOLOGIA BASICA Sistema Rh Gloria Eugenia Barco A

INMUNOHEMATOLOGIA BASICA

Sistema Rh Gloria Eugenia Barco A. Coordinadora Banco de Sangre Hospital Pablo Tobón Uribe Medellín - Colombia

Objetivos del aprendizaje Hacer una revisión del Sistema Rh, su evolución a lo largo de la historia y la importancia de éste en la inmunohematología debido al elevado poder inmunogénico de sus antígenos (especialmente el D).

Agenda 1 Historia del Sistema Rh 2 Definición 3 Significado clínico 4 Consideraciones bioquímicas y genéticas 5 Variantes del Rh

El Sistema Rh es uno de los sistemas más polimórficos e inmunogénicos conocido en los humanos

Historia del Sistema Rh 193 9 Levine y Stetson Suero de la madre de un niño con EHRN que presentó una reacción hemolítica luego de recibir una transfusión de sangre de su esposo.

Historia del Sistema Rh 194 0 Landsteiner y Wiener Describieron anticuerpos desarrollados en cobayos y conejos inmunizados con eritrocitos de monos Rhesus. Karl Landsteiner Estos anticuerpos aglutinaban los glóbulos rojos del 85% de las personas evaluadas y lo llamaron

Factor Rh La inicial Rh corresponde al Macaco Rhesus, un mono cuya sangre tiene la propiedad de poseer un factor aglutinógeno de glóbulos rojos al que unas personas responden, en caso de transfusión. De forma positiva • Produciendo aglutinación de hematíes Rh positivo De forma negativa • En los que el suero Rh no genera la aglutinación de los glóbulos rojos Rh negativo

Historia del Sistema Rh 194 0 Levine y Katzin Encontraron anticuerpos similares en el suero de varias puérperas y en por lo menos uno, registraron reacciones equivalentes a las de los sueros animales anti Rhesus. Macacus Rhesus

Historia del Sistema Rh 194 0 Wiener y Peters Advirtieron anticuerpos de igual especificidad en el suero de individuos cuyos glóbulos rojos carecían del determinante y que habían recibido transfusiones ABO compatibles en el pasado. Alexander Solomon Wiener

Mas tarde… se estableció… Antígenos detectados por los sueros anti. Rhesus animales Antígenos detectados anti-D humano Pero…. el sistema de grupo sanguíneo Rh ya había recibido ese nombre…

Poco después……. De descubrir los anti-D, estudios familiares demostraron que los antígenos D son rasgos genéticos que se transmiten de forma autosómica dominante.

Significado clínico En MEDICINA TRANSFUSIONAL, los D son los antígenos eritrocitarios más importantes después de los A y B. Las personas que carecen de antígenos D no siempre producen los anticuerpos correspondientes.

Significado clínico Con antígeno D Gestación Transfusión Formación de anti-D

Los más inmunogénicos Que los demás antígenos eritrocitarios Transfusión Entre el 30 y el 85 Desarrollan anti-D

Para evitarlo… Se evalúan los antígenos D en la sangre de todos los receptores y donantes para asegurar que todos los receptores D negativo reciban sangre. D negativo

Otros antígenos importantes 4 5 CE c e Pertenecientes al actualmente llamado sistema Rh DCE c e Y sus anticuerpos correspondientes son los responsables de la gran mayoría de los eventos clínicos que involucran al

Consideraciones bioquímicas y genéticas Las hipótesis para explicar los mecanismos genéticos de la expresión de los antígenos del Sistema Rh fueron motivo de controversias científicas entre los investigadores.

Fisher y Race postulan que en el cromosoma 1 existen 3 locus estrechamente relacionados “D” “C” “E” Con dos pares de alelos “C” “c” “E” “e” Y el alelo del “D” que no produce antígeno y lo colocan “d” para significar su ausencia Estos alelos son llamados “HAPLOTIPOS” 194 3

El haplotipo más heredado CDe Para las personas Rh positivo cde Para las personas Rh negativo

Wiener propuso la existencia de un solo gen complejo, con alelos que resultan en varios antígenos del Rh 195 1 Los productos del gen HAPLOTIPO son designados: R Para los que codifican D r Para los que no codifican

Rosenfield propuso un modelo genético con genes estructurales y genes operadores D 1 c 4 C 2 e 5 E 3 197 3 La ausencia de antígeno lleva el signo negativo adelante. Terminología complicada que cayó en desuso

Patricia Tippet propuso la teoría de la existencia de dos genes RHD RHCE 198 6 Responsables de la presencia de los antígenos del sistema Rh, esta teoría fue confirmada por la clonación de ambos genes en 1990 por Colin y cols. RHD y RHCE Individuos RHD positivos Estudios moleculares RHCE Individuos RHD negativos

Entonces…… El locus para el RH está constituido por dos genes homólogos: RHD RHCE • Compuesto por 10 exones cada uno • Ubicados en el brazo corto del cromosoma 1 • En la posición 1 p 34 -36 • Distribuidos en forma de tandem (uno a continuación del otro) • Con orientaciones opuestas enfrentados en su posición 3’ y separados

Proteínas resultantes Proteína Rh. D Proteína Rh. HCE Lleva el antígeno Rh. D Lleva los antígenos - Rh. C - Rhc - Rh. E - Rh. CE

Organización genómica del locus RH humano

“Cajas Rhesus” del gen RHD • Dos regiones de 9 kilo bases • 98. 6% de homología • Papel primordial en la formación del haplotipo RHD negativo den la raza caucásica

La deleción del gen RHD responsable del fenotipo negativo se produjo probablemente por: 1 El entrecruzamiento desigual de las “Cajas Rhesus” 2 De dos haplotipos RH mal alineados en trans dando lugar una “Caja Rhesus” híbrida

Recombinación genética en “trans”

En la población de raza negra La variante alélica RHD Ψ, o pseudogen RHD, esta presente en un 66% de los individuos Rh (D) negativo y corresponde a un gen RHD inactivo.

Modelo de las proteínas Rhesus (Rh. D y Rh. CE) en la membrana del hemtatíe Las proteínas resultantes, Rh. D y Rh. CE, son proteínas transmembrana de múltiples pasos compuestas por 417 aminoácidos. Cada uno de los exones del gen codifica par un segmento de la proteína, de manera que los 10 exones dan lugar a una proteína completa.

La presencia y funcionalidad de la proteína Gen Rh. AG (Rh 50) Permiten la inserción de las proteína Rh en la membrana del glóbulo rojo y la expresión de los antígenos del sistema Rh. RHD “Complejo Rh” RHCE

La presencia y funcionalidad de la proteína Mutaciones en el gen RHAG (Rh 50) Proteínas Rh. AG incompletas No se integran a la membrana del glóbulo rojo No se integran las proteínas Rh Fenotipo “Rh nulo”

Rh nulo • Se describió en la literatura por vez primera que existen personas que carecen del sistema Rh • Su manifestación clínica es una anemia hemolítica crónica con macrocitosis y reticulocitosis • En el año 2003 se tuvo conocimiento de un nuevo caso de una niña de la ciudad de Curitiba, Brasil llamada Leticia Laudino que pocas horas después de nacer, el 18 de octubre del mismo año, fue llevada a la 199 8

Variantes Rh. D FENOTIPOS D parcial D débil

D parcial Los individuos portadores de este fenotipo carecían de un fragmento de proteína lo suficientemente importante como para sensibilizarse tras la exposición a un antígeno Rh (D) completo y desarrollar el correspondiente anticuerpo.

Bases moleculares D parcial Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

DCE CE RH D- CE RH -D 1. Alelos híbridos RHD/RHCE

Resultados • La proteína hibrida resultante puede no expresar el antígeno Rh (D) o • Ver reducida su expresión dependiendo de los exones comprometidos en la recombinación y de como ésta afecte a la configuración que resulta necesaria par la correcta expresión del antígeno Rh (D)

Los aa del Ag Rh(D) Prot Rh. D Prot Rh. HCE Forman parte de la región extracelular de la proteína y están ubicados en los bucles externos 3, 4 y 6 Las diferencias entre las proteínas externas Rh. D y Rh. CE residen 3, 4 yen los bucles: 6 Codificados por Los exones 4, 5 y 7 del gen RHD

Por lo tanto… Gen RHD Combinació n en “Cis” Gen híbrido Expresión alterada del Ag. D Cambia los exones 4, 5 y 7 del gen RHD Po r Los exones 4, 5 y 7 del gen RHCE Prot. bucles 3, 4 y 6 de la prot Rh. CE La mayoría de las categorías D parcial se explican por combinaciones de este

Bases moleculares de diferentes variantes RHD que determinan un fenotipo D parcial

Considerando que… 6 posibles combinaciones Los exones 4, 5 y 7 del gen RHD son críticos 6 alelos híbridos 6 categorías Expresión del Rh (D) FENOTIPOS EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS DIVb Rh 37 (Evans) DVa Rh 23 (Dw) DVI Rh 52 (BARC) DFR Rh 50 (FPTT) DBT Rh 32 DHAR Rh 33

Alelos híbridos / Fenotipos parciales Antígenos expresados ANTÍGENOS EXPRESADOS LOOP 3 (Exón 4) LOOP 4 (Exón 5) LOOP 6 (Exón 7) Rh. CE Rh. D DFR (1), (2), 3, 4, (5), 6/7), 9 FPTT (Rh 50) Rh. D Rh. CE Rh. D DVa 2, 3, 4, 6/7, 8, 9 Dw (Rh 23) Rh. D Rh. CE DIVb 5, 6/7, 8 Evans (Rh 37) Rh. CE Rh. D DVI 3, 4, 9 BARC (Rh 52) Rh. CE Rh. D Rh. CE DHar (5), (6/7) Rh 33, FPTT (Rh 50) Rh. D Rh. CE DBT (6/7), 8 Rh 32 Fenotipos Epítopos Rh. D Antígenos de baja frecuencia

La expresión del antígeno Rh (D) puede variar entre alelos pertenecientes a una misma categoría, al igual que la reactividad frente a diferentes anticuerpos anti-Rh (D) dependiendo de la densidad antigénica de las proteínas resultantes.

Los fenotipos parciales DIIIa DIIIb DIIIc Son proteínas híbridas, pero los alelos que las produjeron no son resultado de combinaciones de los exones 4, 5 y 7, sino de otros exones que no afectan los bucles 3, 4 y 6 de la proteína del Rh. D.

Los fenotipos parciales Bucle 2 del Exón 2 del Gen RHD Bucle 2 del Exón 2 del Gen RHCE D IIIb Bucle 3 del Exón 3 del Gen RHD Bucle 3 del Exón 3 del Gen RHCE D IIIc

Los individuos D IIIc, se inmunizan contra antígenos Rh. D completos. Esto significa que cambios en la estructura peptídica de la proteína, pueden afectar bucles extracelulares y crear nuevos epítopos antigénicos.

Intervalo

Bases moleculares D parcial Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína Mas de 10 fenotipos D parcial son debidos a mutaciones puntuales localizadas en los bucles extracelulares. Las proteínas resultantes son muy diversas y el grado de expresión del antígeno Rh (D) difiere dependiendo de: • La localización • El tipo de sustitución

Fenotipos parciales - Mutaciones puntuales Los que más se inmunizan cuando reciben sangre Rh. D positivo son: DVII Expresa el antígeno Rh 40 (Tar) Cambio de aa Leucina por Prolina en la posisición 110 del bucle 2 de la proteína Rh. D. DNB Cambio de aa de Glicina por Serina en la posición 355 del bucle 6.

Bases moleculares de diferentes variantes RHD que determinan un fenotipo D parcial

Fenotipos parciales - Mutaciones puntuales LOOPS POSICION EXTERNO ES DE LOS S AA AMINOACIODOS SUSTITUÍDOS FENOTIPOS 1 54 Leu Pro DMH 2 103 110 Ser Leu Pro G (neg Rh. D) DVII (Tar Rh 40) 3 166 His Pro DFW 4 229 233 234 235 Arg Glu Arg Lys Lys Trp Thr DHR DHK DYU DHO 5 283 285 Thr Cys Ile Tyr DHM DIM 6 353 354 355 358 Gly Ala Gly Met Arg Asp Ser Thr DNU DII DNB DWI

Bases moleculares D parcial Las bases moleculares que explican este fenotipo pueden ser de 3 tipos: 1. Alelos híbridos RHD/RHCE 2. Mutaciones puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína 3. Mutaciones puntuales dispersas

3. Mutaciones puntuales dispersas Numerosos fenotipos D parcial son fruto de múltiples mutaciones puntuales ubicadas en diferentes regiones de la proteína Rh. D. Por ejemplo: DIIIa DIIItipo IV DIVa DAR Pueden estar asociadas a otras mutaciones responsables de categorías bien definidas de D parcial o a otras variantes alélicas

Categorías del antígeno Rh. D Los antígenos Rh. D parciales fueron inicialmente clasificados en categorías: • en función de la presencia • o ausencia de 9 epítopos presentes en el antígeno Rh Determinados por reacciones de aglutinación de los glóbulos rojos cuando eran testados contra anticuerpos monoclonales. Anti-ep. D 1 a anti-ep. D 9 ep. D: epítope del Rh. D

Categorías de antígenos D parcial CATEGORÍAS EPÍTOPOS PRESENTES ep. D 1 ep. D 2 ep. D 3 ep. D 4 ep. D 5 ep. D 6 ep. D 7 ep. D 8 ep. D 9 II + + + - IIIa + + + + + IIIc + + + + + IV a(Goa) - - - + + + - IV b - - + + - V a (Dw) - + + + + VI - - + + - - + VII (Tar) + + + + - + DFR - - + + - - + Por esta batería de pruebas con 9 anticuerpos monoclonales (Mo) contra epítopos del Rh podemos observar que el Rh. D categoría VI (DVI) solo presenta 3 epítopos del Rh. D.

En un estudio posterior… Realizado con 30 anticuerpos monoclonales se verifico que la categoría DVI solo presenta 6 epítopos propios del Rh D. CATEGORÍAS NEGATIVOS POSITIVOS II 5 25 IIIa-IIIc 0 30 IIIB 1 29 IVa 10 20 IVb 11 19 Va 8 22 VI 24 6 VII 3 27 D parciales 30 epítopos Las pruebas negativas (24) significan que estos epítopos del Rh. D están ausentes porque fueron reemplazados por epítopos del Rh. CE.

Conclusión Rh. D parcial El fenotipo categoría VI es el de más alta Frecuencia entre los D parciales y por la ausencia los epítopos del de la mayoría de Rh. D individuos los DVI se inmunizan fácilmente cuando son transfundidos con sangre Rhcon positivo, produciendo anticuerpos Un kit 6 sueros monoclonales contra epítopos delcontra Rh. D, los pueden indentificar las categorías más importantes entre epítopos ausentes. Rh. D parciales

Variantes Rh. D FENOTIPOS D parcial D débil

D débil • Objeto de discusión y controversia • La información actual disponible ponen de manifiesto su HETEROGENEIDAD • Bajo este término se han ido incluyendo una amplia variedad de fenotipos D de expresión débil • Difícil establecer protocolos frente a los diversos fenotipos D débil

¿Cómo se explica el D débil? Mutaciones puntuales del Gen de aa en la RHD región transmembrana o intracelular. cambio

Aunque…. Estos cambios de aa no son inmunogénicos pueden: Dificultar la inserción de la proteína Rh. D en la membrana del glóbulo rojo Afectar su interacción con la glicoproteína Rh. AG (Rh 50) Fenotipo D débil

Fenotipos Rh. D débil Diversos tipos de Rh. D débiles han sido descritos de acuerdo con las posiciones de cambios de aminoácidos. La numeración usada es de acuerdo a la frecuencia en que aparecen en la población, siendo los números mas bajos, los más frecuentes.

Fenotipos Rh. D débil TIPOS DE Rh. D débil POSICIONES DE LOS AA 1 270 Val Gly Transmembrana 2 385 Gly Ala Transmembrana 3 3 Ser Cys Intracelular 4. 0 201 223 Thr Phe Arg Val Transmembrana Trp Thr Phe Cys Arg Val Transmembrana Thr Phe Ile Arg Val Thr Transmembrana 4. 1 4. 2 16 223 201 223 342 201 AMINOACIODOS SUSTITUÍDOS LOCALIZACIÓN Transmembrana Los 5 fenotipos D 149 débil de los tipos. Ala 1 al 4 Asp representan más del 90% de los 11 295 Met Ile Transmembrana fenotipos D débil detectados 15 282 Gly Asp en europeos. Transmembrana 20 El 417 4 se ha dividido Phe a su Servez en varios subtipos. Intracelular D débil tipo

Fenotipos Rh. D débil La forma más débil corresponde al fenotipo DE L Del La expresión del antígeno es tan extremadamente débil que solo puede demostrarse con técnicas de adsorción El fenotipo DEL es el menos frecuente 30% de los donantes son portadores de un fenotipo DEL ligado a la variante RHD

Fenotipos Mas similitudes que diferencias D parcial D débil Fronteras virtuales

Representación de variables cualitativas y cuantitativas del antígeno Rh. D en la membrana del glóbulo rojo

Términos importantes Cuantitativamente normal Cualitativamente normal Concentración de sitios antigénicos normal (entre 10. 000 y 30. 000 sitios por membrana de glóbulo rojo). Presenta todos los bucles externos típicos del Rh, con todos sus epítopos.

Rh. D normal Rh. D parcial Cuanti y cuali normal Rh. D débil Cuanti y cuali normal Cuanti normal y cuali anormal Concentración de sitios antigénicos normal y además el Rh. D presenta los bucles externos típicos con todos sus epítopos Concentración reducida de sitios antigénicos, pero la prot no presenta cambios y todos los epítopos del Rh. D están Concentración normal, pero la prot Rh. D es una variante cuali con epítopos antigénicos no típicos, incorporados del Rh. CE Rh. D parcial débil Cuanti y cuali anormal Concentración reducida de sitios antigénicos y con epítopos antigénicos no típicos del Rh. D

Significado de los antígenos D débil - D parcial La estrategia ideal en donantes sería el uso de un reactivo anti D capas de aglutinar directamente a la mayoría de los antígenos D. Por lo que tenemos que utilizar más de un reactivo y en última instancia utilizar la técnica de la antiglobulina para confirmar el Rh. D.

Qué hacer… Como lo sugieren los estándares de la AABB: Analizar la expresión débil del antígeno D en las muestras de los donantes de sangre y en caso de ser positivo se debe rotular la unidad como. Rh. D+

Qué hacer… La estrategia más adecuada para el tipaje Rh (D) de pacientes y gestantes es la que está fundamentada sobre: • La información existente • El sentido común • Recursos disponibles Para los receptores se establece el uso de un anti-D monoclonal de tipo Ig. M que no aglutine a las variantes DVI. Y que los portadores de esta variante sean catalogados como: Rh. D negativo

Nomenclatura Sistemas de nomenclatura han sido desarrollados para transmitir la información genética y serológica del sistema Rh. 1. Fisher- Race 2. Wiener 3. Rosenfields Numerical 4. ISBTs Numerical

Conclusiones • El sistema Rh es uno de los sistemas más polimórficos e inmunogénicos conocido en los humanos • Es el más importante en la práctica transfusional después del sistema ABO • A pesar de la evolución, aún nos queda mucho por definir

Bibliografía • Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M, eds Blood transfusion in clinical medicine. 10 th ed. Oxford Blackwell Science, 1997: 151 -85 • Eduardo Muñiiz Díaz, C Canals Surís, R Montero Tejedor, N Nogués Galvez. Laboratorio de Inmunohematología. Banc de Sang i Teixits. Barcelona. Importancia Clínica de las variantes RH (D) en pacientes, donantes y gestantes • Connie M. Westhoff, SBB, Ph. D. The structure and function of the Rh antigen Complex. NIH National Institutes of Health

Gracias… gbarco@hptu. org. co Consultas: