Indagine citogenetica in ematologia Indagine di laboratorio che

Indagine citogenetica in ematologia • Indagine di laboratorio che rileva la presenza di anomalie cromosomiche nelle cellule patologiche • Riconosce le anomalie “primarie” (presenti in tutte le cellule anomale), responsabili delle fasi precoci di trasformazione • Identifica le anomalie “ secondarie” responsabili delle fasi di evoluzione clonale • Deve identificare le lesioni non rilevanti per la patogenesi della malattia in quanto semplice espressione della instabilità genetica

Cosa serve per l’indagine citogenetica in ematologia • 5 -20 X 106 cellule vive, messe in coltura sterilmente entro 24 ore dal prelievo • Le cellule devono essere in grado di dividersi (midollo osseo, sangue periferico se contaminato da cellule immature, linfonodi, milza, biopsie tissutali patologiche) • Passaggi tecnici relativamente semplici (blocco delle metafasi, ipotonizzazione, allestimento dei vetrini, bandeggio) • Un tecnico di laboratorio / biologo / medico esperto (anni di training) nell’analisi della morfologia dei cromosomi • Sistema di analisi automatizzata del cariotipo (economicamente vantaggioso per centri medio-grandi)

Significato delle alterazioni citogenetiche nei tumori • Trisomie, duplicazioni, amplificazioni – aumento di materiale genetico – Aumento del numero di copie di un oncogene • Monosomie o delezioni – perdita di materiale genetico – Perdita di geni oncosoppressori • Traslocazioni, inversioni – spostamento di geni o parte di geni – Geni di fusione con nuove funzioni o perdita di regolazione

LIMITS OF CYTOGENETIC ANALYSIS • • VIABLE CELLS REQUIRED LOW MITOTIC INDEX: FEW METAPHASE CELLS SENSITIVTY (No. of cells – size of DNA gain or loss) TIME CONSUMING (At least 3 days, normally 7 -30)

Universita’ di Bari Diagnosi del cancro: v approccio citogenetico (es. cromosoma Philadelphia nella leucemia mieloide cronica) e citogenetico molecolare (FISH)

Universita’ di Bari Sonde usate in FISH: - WCPs (Whole Chromosome Paints); - PCPs (Partial Chromosome Paints); - sequenze ripetute: centromeriche (alfoidi) - sonde YAC/BAC/PAC. satelliti telomeriche

Universita’ di Bari Aberrazioni numeriche citogenetica in metafase citogenetica in interfase - WCP e/o PCP - sonde centromeriche (alfoidi) - locus-specifiche (sonde. YAC/BAC/PAC) - sonde centromeriche (alfoidi)

Universita’ di Bari Aberrazioni strutturali citogenetica in interfase citogenetica in metafase - WCP; - PCP; - sonde locus specifiche (YAC/BAC/PAC) - sonde YAC/BAC/PAC.

Universita’ di Bari Esempio di uso di sonde WCP ed alfoidi per lo studio di aberrazioni numeriche e strutturali in un caso di AML:

Esempio d’uso di sonde YAC per delimitare i breakpoints in 1) 2) 3) una t(2; 9)(q 14; p 12) in AML:

Universita’ di Bari Esempio d’uso di WCP nello studio di riarrangiamenti complessi [una “three-waytranslocation” t(8; 13; 14) in un caso di AML]

Universita’ di Bari

Universita’ di Bari Esempio di uso di una sonda PCP per studiare una t(1; 7)(p 36; q 34) in Leucemia Mieloide Acuta

Universita’ di Bari Esempio di uso di WCP per lo studio di aberrazioni cromosomiche sbilanciate (un caso di AML):

FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION DUAL COLOUR FISH TO DETECT UNBALANCED REARRANGEMENTS TRISOMY Control probe HYBRIDIZATION Test probe NORMAL

FISH SHOWS +12 in interphase cells

DUAL COLOUR FISH TO DETECT DELETIONS DELETION LOST Control probe HYBRIDIZATION Test probe NORMAL

7 q 31 deletion in AML 7 q 31 cosmid Control probe

TWO APPROACHES TO DETECT CHROMOSOME TRANSLOCATIONS BY DUAL COLOR FISH Fusion signal Normal Translocation Split signal

Universita’ di Bari Detection di geni di fusione: esempio di sistema a 4 -spots:

Universita’ di Bari Detection of geni di fusione: esempio di sistema a 5 -spots:

Universita’ di Bari Detection del gene di fusione BCR/ABL nella CML Ph+:

Detection of geni di fusione: esempio di sistema a 6 -spots:

Universita’ di Bari Detection di geni di fusione originati per inversione in AML:

Caratterizzazione di una delezione interstiziale del cromosoma 21: 500 Kb breakpoint prossimale DELETA NON DELETA breakpoint distale

Amplificazioni: Double minutes MYC Homogeneously staining regions (HSR)

Problema n. 1:

Problema n. 2:

Problema n. 3:

SPLIT SIGNAL APPROACH FOR THE DETECTION OF TRANSLOCATIONS MLL RERRANGEMENT t(9; 11)(p 21; q 23) interphase metaphase Fusion signal = normal chromosome Split signal = rearrangement

FISH as a diagnostic tool in AML Characteristics Interphase cells analyzable and improved resolution Relatively quick Advantage vs cytogenetics Detection of subtle rearrangements Detection of minor clones Result in 24 -72 hours Limits vs cytogenetics Costs 2 anomalies / experiment Approx 50 € / probe used

Genetica Molecolare • SKY o M-FISH: uso di 24 sonde painting in fluorescenza per tutti i cromosomi, utile per sensibilità nei cariotipi complessi • RT-PCR: amplificazione di geni di fusione e quantitativa, utile nel monitoraggio della malattia minima residua • Arrays: analisi dell’espressione genica, potenzialità di incrementare la diagnostica, migliorare la classificazione di alcune patologie, utile nella prognosi

Universita’ di Bari M-FISH allows to investigate complex karyotypes:

1. Preparare il chip di DNA usando cloni genomici selezionati 2. Generare una soluzione d’ibridazione contenente una mix di c. DNA marcati in maniera fluorescente 3. Incubare la mix di c. DNA marcati in maniera fluorescente con il chip di DNA 4. Individuare il c. DNA legato usando la tecnologia laser e conservare i dati in un computer. 5. Analizzare i dati usando metodi computazionali. Il verde rappresenta il DNA di controllo dove o DNA o c. DNA derivante da tessuto normale e’ ibridato con il DNA target. Il rosso rappresenta il DNA campione dove o il DNA o il c. DNA e’ ottenuto dal tessuto in studio ibridato con il DNA target. Il giallo rappresenta la combinazione di DNA controllo + campione dove entrambi ibridizzano in ugual misura con il DNA target. Ogni spot su un array è associato con un particolare gene. Ogni colore in un array rappresenta o il tessuto di controllo o il tessuto in studio (campione). A seconda del tipo di array usato, la localizzazione e l’intensità del colore se il gene, o la mutazione, e’ presente nel controllo e/o nel DNA campione. Inoltre fornisce anche una stima del livello di espressione del/i gene/i nel DNA campione e controllo.

v Expression chips: il DNA immobilizzato su supporto è c. DNA ottenuto dal m. RNA di geni noti o oligonucleotidi corrispondenti, mentre i DNA da ibridare (controllo e campione) sono c. DNA derivati dagli m. RNA del tessuto normale e patologico rispettivamente; v Array CGH: ogni spot di DNA target ha una localizzazione cromosomica nota, i DNA da ibridare (controllo e campione) sono estratti dal tessuto normale e patologico rispettivamente; v Mutation microarray: ogni spot differisce dagli altri per uno o pochi nucleotidi specifici. Ognuno di essi può rappresentare un oligonucleotide specifico per un dato SNP (Single Nucleotide Polymorphism) di un determinato gene. Si ibrida solo DNA genomico derivato dal campione da testare per una determinata patologia nota essere associata a determinati SNPs.

Expression microarrays:

Array-CGH