Imunokompatibilnost nanoestica srebrauinak na mononuklearne stanice humane periferne
Imunokompatibilnost nanočestica srebra-učinak na mononuklearne stanice humane periferne krvi Javna prezentacija za ocjenu teme doktorske disertacije Pristupnica: Barbara Vuković, mag. med. biochem. Osijek, 29. 11. 2018.
Nanotehnologija & nanomedicina NANOMEDICINA Dijagnostika / praćenje Terapija Detekcija Nanotehnologija - „znanost o malom“ - svojstva materije na nanoskali (10 -9) Nanotoksikologija
Nanotehnologija u fokusu EU • Veliki potencijal ~ veliki rizik ? • Europska komisija (EC) – nanotehnologija – jedna od 6 KETs u razvoju industrije i medicine • HORIZON 2020 - KETs – ključne za razvoj, konkurentnost i obnovu europske proizvodnje, s naglaskom na očuvanje zdravlja, energije i okoliša • EU, 2011. Commission Recommendation – definicija nanomatrijala (NMs): NMs - sadrže čestice dimenzija 1 -100 nm
Nanomaterijali / nanočestice • Vrste NM: a. po strukturi: NANOČESTICE, nanovlakna, nanocjevčice, nanokompoziti…. b. po sastavu: organski-fulereni (alotrop. modif. ugljika), anorganski-metali (Au, Ag, Cu, Si…) Preuzeto od: Ivanković M. Nanometrijali i nanoproizvodi
Nanomaterijali / nanočestice • Nanočestice (engl. nanoparticles, NPs) jedinstvena svojstva ! • → male dimenzije / velika površina – velika REAKTIVNOST ali i …. velika TOKSIČNOST ? ? ? → enormna industrijska i biomedicinska primjena (nanotehnologija) vs. sigurnost za zdravlje (nanotoksikologija) • NEISTRAŽENO PODRUČJE !
Nanomaterijali / nanočestice Putevi ulaska nanočestica u organizam – spontano ili namjerno - Jedinstvena biodistribucija i međudjelovanje s komponentama stanica i tkiva Preuzeto od: Ivanković M. Nanometrijali i nanoproizvodi
Nanomaterijali / nanočestice - Lako prolaze biološke barijere ! Izvor: https: //www. researchgate. net/publication/320132877_Nanoparticles_Carrying_Biological_Molecules_Recent_Advances_and_Applications
Biokompatibilnost NPs – interakcije s krvnim sastojcima - Različite nanočestice, različiti učinci na organizam
Metalne nanočestice – posebnost svojstava • Metalne nanočestice – glavna uloga nanomaterijala u biomedicini • Au. NPs, Ag. NPs, Cu. NPs, Fe 2 O 3 NPs, Zn. O NPs, Ti. O 2, Si. O 2 NPs, … • Jedinstvena OPTIČKA, FIZIKALNO-KEMIJSKA I BIOLOŠKA SVOJSTVA !
Metalne nanočestice – posebnost svojstava • a) b) c) d) e) f) g) h) Fizikalno-kemijska svojstva NPs: kemijski sastav naboj oblik kristalinizacija veličina i distribucija topljivost u medijima vrsta sinteze i nečistoće površinske (funkcijske) molekule – omotači (engl. coating/ capping agents) • imunotoksičnost metala vs. imunomodulatorni učinak NPs → ovsinost o fizikalno-kemijskim svojstvima NPs → ovisnost o dozi i vremenu izloženosti NPs - važna evaluacija svojstava nanoproizvoda prije primjene !
FOKUS ISTRAŽIVANJA • SREBRNE NANOČESTICE (Ag. NPs) – najzastupljenije metalne nanočestice ! • Antimikrobni učinak srebra – antibakterijsko, antivirusno, antifungicidno • Biokompatibilnost !? • Male dimenzije (d < 100 nm), velike površina (~ 15 000 atoma Ag)- moguća biomedicinska primjena niže doze srebra! • Biomedicinska primjena nanosrebra- antibakterijska sredstva i zavoji za rane, biofilm na/u kateterima, kirurškim instrumentima, implantatima, protezama, zubnim punjenjima… • nanovektori, nanonosači, biosenzori…
SREBRNE NANOČESTICE • Biomedicinska primjena Ag. NPs – osnovni preduvjet: IMUNOKOMPATIBILNOST • Dizajn Ag. NPs → mogućnost upravljanja imunološkim odgovorom ! • Mogući učinci Ag. NPs: 1. Imunomodulatorni učinak – poželjan – - stimulacija - „nanovaccinology” – nanovektori-adjuvansi - supresija - sprječavanje Gv. HD, th upalnih bolesti, alergija i AIB 2. Imunotoksični učinak - nepoželjan- upala, AIB, te podložnost infekcijama i rak…
OMOTAČI - STABILIZATORI • Ovisno o mikrookolišu, Ag. NPs mijenjaju svojstva (aglomeracija/oksidacija/otpuštanje Ag+) • Capped Ag. NPs – dodatak molekula / stabilizatora ”omotači” • Zaštitna (reakcije s okolišem, oksidacija), stabilizacijska (veličina, topljivost, agregacija), funkcionalna uloga – nova svojstva, nova aktivnost ! • Stabilnost + nova svojstva+nove funkcije • Toksičnost: Ag+>colloidal Ag. Cl>Ag. NPs („bare”)> capped Ag. NPs • Toksičnost omotača ? ?
NAŠ ZADATAK-ISPITIVANJE IMUNOKOMPATIBILNOSTI • Problem – klasične metode ispitivanja hemokompatibilnosti – interferencije Ag. NPs • Lažno + / - rezultati • ISO 10993 -4: 2017 -Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood – NIJE PRIMJENJIV ! • ISO standardizacija metoda za NMs- NIJE DOVRŠENA • EC – brojni timovi za standardizaciju metoda (SCENIHR, JRC, …. ) → preliminarne smjernice metoda za : - detekciju i karakterizaciju nanomaterijala - In vitro analize interakcija s biološkim sustavima (proteini, stanice, organi, tkiva)
ISPITIVANJE HEMOKOMPATIBILNOSTI • SCENIHR - smjernice • Nekoliko faza evaluacije toksičnosti: 1. Rizik od otpuštanja nanočestica 2. Širenje organizmom (ulazak u krvotok i tkiva) 3. Citotoksičnost, genotoksičnost, imunotoksičnost → naš zadatak !
CILJEVI ISTRAŽIVANJA-OPĆENITO • Ispitati različite potencijalno toksične učinke različitih vrsta srebrnih nanočestica na stanice humanog imunološkog sustava • Definirati laboratorijske metode procjene imunokompatibilnost Ag. NPs – standardizacija ! • Dati smjernice za dizajn sigurnih nanočestica na bazi srebra
MATERIJALI I METODE • Ispitat ćemo: 4 VRSTE Ag. NPs prema omotaču: 1. PVP – polyvinylpyrrolidone – neutralni polimer - najčešći 2. AOT – bis(2 -etylhexyl)-sulfosuccinate (Aerosol. OT) - anionski surfaktant 3. PLL – poly-L-lysine - kationski polimer 4. BSA – bovine serum albumin - amfoteran
MATERIJALI I METODE z potential, m. V Size, nm (surface charge) -27. 78 ± 1. 93 13. 31± 4. 73 Ag. NP type Coating Polydispersity index, Pd. I 0. 11 AOT-Ag. NP PLL-Ag. NP bis(2 -etylhexyl)sulfosuccinate (AOT) poly-L-lysine +38. 6± 6, 9 13. 5± 7. 1 0. 10 PVP-Ag. NP polyviniylpyrrolidone -5. 64 ± 0. 84 8. 55 ± 1. 90 0. 52 BSA-Ag. NP bovine serum albumin +8. 85 ± 0. 72 6. 74 ± 2. 26 0. 25 • Sinteza Ag. NPs – redukcija Ag. NO 3 – metoda modificirana na Institutu za medicinska istraživanja i medicinu rada u Zagrebu (IMI) • Kategorija malih NPs (< 50 nm) • Evaluacija svojstava-Zetasizer Nano ZS
4 vrste Ag. NPs – UV/VIS (SPR) i TEM – formacija u nanostrukturu
MATERIJALI I METODE • ISO 10993 -4: Ispitivanje hemokompatibilnosti – svježi, humani uzorci (unutar 4 h)! • Zdravi ispitanici – normalan leukogram • Venska krv – EDTA-antikoagulans • Puna krv – izolacija mononukleara – limfocita i monocita (PBMC) – na gradijentu gustoće (Lymphoprep) • Hematološki brojač (Sysmex) – određivanje broja stanica u punoj krvi i u izolatu • Protočni citometar BD FACSCalibur
CITOTOKSIČNOST / GENOTOKSIČNOST • ulazak NPs u stanice (engl. cellular uptake)– osnovni preduvjet !
CILJ ISTRAŽIVANJA – UČINAK CITOTOKSIČNOSTI • 1. Analiza citotoksičnosti a. Dokazati stanični uptake (internalizaciju) Ag. NPs u stanice (PBMC) b. Primjenjena / internalizirana koncentracija – međuovisnost c. Proporcija stanične smrti (apoptoza/nekroza) – ovisi o vrsti (omotaču), koncentraciji Ag. NPs i vremenu izloženosti d. Oksidativni stres-produkcija ROS-mehanizam smrti e. Evaluacija toksičnosti samih omotača i ionskog srebra
CILJ ISTRAŽIVANJA - CITOTOKSIČNOST • 1. a) Stanični uptake - određivanje i kvantifikacija uptake-a – METODA PROTOČNE CITOMETRIJE (FCM) • Relativni porast raspršenja svjetla u desecima tisuća stanica u kratkom roku • ↑ SSC (engl. side-scatter) – porast unutrašnje kompleksnosti („granuliranosti”) stanice • FSC (engl. forward-scatter) – veličina stanice – ostaje ista • TEM – vizualizacija uptake-a – 1 reprezentativni uzorak Izvor: Ibuki Y, Toyooka T. Nanotoxicity: methods and protocols
Stanični uptake - mjerenje Protokol Ibuki / Toyooka FCM – 10 000 skupljenih događaja (engl. events) Naš pokus: 6 uzoraka X 10 000 stanica = 60 000 stanica Tretirane / netretirane stanice Normalizacija rezultata- „MFI metoda” Omjer: SSC- MFI (tret. )/SSC-MFI (netret. ) > 1, 0 -dokaz uptake-a • Ovisnost o koncentraciji Ag. NPs (4) / vremenu izloženosti (2) • • •
CILJ ISTRAŽIVANJA - CITOTOKSIČNOST 1. b) Primjenjena / internalizirana koncentracija • Ispitivane koncentracije Ag. NPs – 1, 5, 10 i 25 mg/L • Ispitivano vrijeme inkubacije – 1 h i 3 h • Internalizirana doza ~ biološki učinak Ag. NPs ! 1. Rastuća koncentracija / (relativni) porast uptake-a 2. Porast vremena inkubacije / (relativni) porast uptake-a
Apoptoza / nekroza • 1. c) Stanična smrt (apoptoza/nekroza) • • Protokol Ibuki / Toyooka metoda PROTOČNE CITOMETRIJE FITC Annexin V / PI Mjerenje udjela (%) stanica u ranoj apoptozi / kasnoj apoptozi / 1° nekrozi / živih stanica za tret/netret PBMC - Ovisno o vrsti Ag. NPs (4) - Ovisno o koncentraciji (4) / vremenu izloženosti (2) - Određivanje „netoksične” koncentracije (> 90 % živih stanica)
Oksidativni stres (ROS) 1. d) Oksidativni stres-produkcija ROS-mehanizam smrti • Metoda PROTOČNE CITOMETRIJE • 3 fluorescentne boje: 1. DCFH-DA – ukupni ROS u stanici-↑ MFI 2. DHE – detekcija superoksida- ↑ MFI 3. Di. OC 6 – promjena MMP - ↓ MFI • netoksična koncentracija, 4 vrste Ag. NP, 2 vremena inkub. • 6 x 10 000 stanica • Normalizacija rezultata – „MFI” metoda – relativan porast ili pad fluorescencije kod tretiranih st. u odnosu na netret. stanice
ROS - FCM
Utjecaj omotača i ionskog srebra • 1. e) Evaluacija toksičnosti omotača i ionskog srebra • PVP, AOT i PLL • Ag+ • FCM – Annexin V / PI
2. CILJ ISTRAŽIVANJA – UČINAK GENOTOKSIČNOSTI 1. Ag. NPs – oštećuju DNA 2. Ovisnost o vrsti (omotaču) i koncentraciji Ag. NPs • ALKALNI KOMET TEST (single-cell gel electrophoresis) • Parametri za evaluaciju: a. Duljina repa kometa (TL) b. Intenzitet repa kometa (TI) • 6 uzoraka X 100 kometa = 600 kometa
3. CILJ ISTRAŽIVANJA – UČINAK IMUNOTOKSIČNOSTI • Interakcije NPs s imunološkim sustavom – RAZNOLIKE, KOMPLEKSNE, NEDOVOLJNO ISTRAŽENE ! • ISO 10993 -4: Ispitivanje hemokompatibilnosti – imunološki sustav – humani leukociti (imunokompatibilnost) • Siguran + ciljani dizajn NPs - in vitro evaluacija ovih interakcija– ključna ! • Učinak Ag. NPs na funkcionalnu aktivnost humanih leukocita – nedovoljno istražena ! • Životinjski modeli – citotoksičnost i imunotoksičnost Ag. NPsovisno o koncentraciji • Kulture stanica-Ag. NPs – produkcija citokina-oprečni rezultati
UČINAK IMUNOTOKSIČNOSTI • Ag. NPs – urođena i stečena imunost 1. Urođena-aktivacija Mo/Mφ sustava (TLR) 2. Stečena - stanična i humoralna imunost – aktivacija T – i B-staničnog odgovora (APC uptake) • Aktivacija T-staničnog odgovora – moduliranje odnosa Th/Tc (CD 4+/CD 8+) • Inhibicija virusa (HIV) vezanjem na disulfidne veze između virusa (gp 120) i CD 4+ receptora na stanici (Th)- ovisno o veličini i omotaču NPs – vakcine ! • Imunoterapija u liječenju karcinoma - indukcija CD 8+ Tc odgovora protiv tum. stanica !
Analiza djelovanja na površinske stanične receptore • Djelovanje na površinske receptore stanica - zaštitna ili štetno djelovanje Ag. NPs ? ? ? • Metoda PROTOČNE CITOMETRIJE • Površinski biljezi limfocita i monocita-CD biljezi • T-limfocitni: CD 3 (pan), CD 4 (Th, Mo), CD 8 (Tc) • B-limfocitni: CD 19 (-) • Monocitni: CD 14 (-), CD 33, CD 64 • Aktivacijski: CD 25, CD 38, CD 69, HLA-DR • MFI (odgovara broju receptora na površini) i % pozitivnih stanica na ogradi svih (živih) PBMC • Praćenje promjena broja receptora/ odnosa staničnih populacija nakon interakcije s Ag. NPs – ovisno o vrsti omotača
ZNANSTVENI DOPRINOS • Prilagodba, validacija i standardizacija metode za procjenu imunokompatibilnosti metalnih NPs • Identifikacija učinaka NPs na imunološki sustav i manipulacija-ključno za budućnost nanobiomedicine • Dizajn sigurnih / ciljanih nanočestica na bazi srebra
Bilo kuda… HVALA NA PAŽNJI ! …nano svuda !
- Slides: 35