Imunohistochemie IHC IHC principy imunohistochemie princip imuno metod

Imunohistochemie (IHC)

IHC principy imunohistochemie

princip imuno- metod = vazba molekul imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami

• imunohistochemie (ihc): všechny techniky využívající mono-či polyklonální značené protilátky (Ab), kterými lokalizujeme a vizualizujeme příslušné tkáň. antigeny (Ag) • vztah klíče (Ab, volná) a zámku (Ag, tkáň. Ag)

základní typy ihc metod 1) přímá: primární Ab značená přímo 2) nepřímá dvojstupňová: imunologická vazba sekundární značené Ab na Ab primární 3) nepřímá trojstupňová: např. streptavidin-biotin-komplex (SABC)

ad 1) přímá metoda • primární Ab značená přímo • nutná dostatečná koncentrace hledaného Ag ve tkáni • nativní řezy (pro parafín málo citlivé)

ad 2) nepřímá dvojstupňová • komplikovanější na přípravu x citlivější 1. první „vrstva“: neoznačená Ab (Ig nebo sérum) specifická pro hledaný tkáň. Ag = primární Ab 2. druhá „vrstva“: značená Ab proti Fc fragmentu primární protilátky = sekundární Ab, vazba imunologická

ad 3) nepřímá trojstupňová • amplifikační = zesílení signálu při malém množství molekul Ag ve tkáni 1. primární specifické antisérum proti Ag prokazovanému ve tkáni 2. neznačená specifická Ab proti primární = spojovací = můstek 3. značený komplex streptavidinbiotin(SABC)

typy Ab • polyklonální: – mnoho aktivovaných klonů B lymfocytů proti různým oblastem určitého Ag nebo proti směsi Ag – vysoká senzitivita x nízká specifita • monoklonální: – 1 klon – nízká senzitivita x vysoká specifita

značení Ab • fluorescenční značky • enzymy: např. peroxidáza

obecné schéma ihc protokolu 1) 2) 3) 4) 5) odběr a fixace tkáně krájení a napínání řezů optimalizace prezentace Ag blok aktivity endogenních enzymů blok pozadí

obecné schéma ihc protokolu 1) 2) 3) 4) 5) 6) vazba primární Ab vazba sekundární Ab detekční systém demaskování komplexu Ag-Ab barvení pozadí (buň. jader) dehydratace a montáž preparátu

ad 1) odběr a fixace • pro ihc skloubení zachování morfologie x zachování antigenicity a minimalizace artefaktů • průkaz Ag nutno in situ (v místě norma výskytu ve tkáni • během fixace artefakty • fixace pufrovaným neutrálním formalínem

ad 2) krájení a napínání • napnutí na kapce vody • skla potažená lepivou hmotou – – bílek-glycerin želatina poly L-lysin APES (3 -amino-propyl-triethoxysilan) • účinná a trvanlivá! (var v MT, lázni)

ad 3) optimalizace prezentace Ag • lepší fixace x horší prokazatelnost tkáň. Ag • ošetření tkáň. řezů, aby povrchy lépe „nabízely“ Ag = regenerace Ag (Ag retriever) • snižují přilnavost k povrchům

ad 3) optimalizace prezentace Ag • použití proteáz • MT • vodní lázeň

ad 4) blok endogenní aktivity enzymů • pro průkaz vazby Ag-Ab běžně použití Ab značených enzymem (peroxidáza…) • přirozený výskyt ve tkáni – falešně pozitivní výsledky reakcí

ad 4) blok endogenní aktivity enzymů • blok endogenní peroxidázy! – 1 -3% H 2 O 2 v methanolu nebo destil. H 2 O po dobu 20 – 30 min • blokování avidinu a biotinu (ledviny a játra) – blok s 0, 1 – 0, 01% avidin v PBS 20 min a následně blok 0, 01 – 0, 001% biotinem v PBS 20 min

ad 5) blok pozadí • nespec. reakce pozadí – falešná pozitivita • falešně pozit. nespecifická reakce pozadí: – aktivita endogenních tkáň. enzymů (vysycení enzymů jejich substrátem) – endogenní avidin-biotinová reakce (endogenní biotin: játra, ledviny, tuk. tkáň. , mléčná žláza) – kontaminace řezů nebo reagencií cizorod. látkami

ad 5) blok pozadí – křížové reakce (zkřížená reaktivita) Ab s podobnými epitopy na různých Ag – nespecif. vazba primární Ab na kolagen, laminin, elastin, proteoglykany, keratin, tuk. tkáň a jiné pojiv. struktury (důsledek fixace aldehydy) – nespecif. vazby v důsledku elektrostat. interakcí – poškození řezu (vyschnutí!)

ad 5) blok pozadí – difúze tkáň. Ag do okolí – nespec. reakce sekundární, popř. terciární Ab s Fc receptory imunoglobulinů ve tkáni (cytoplazmat. membrány, často makrofágy a granulocyty) – Ag pohlcen makrofágy – nekróza tkáně (vylití cytoplazmat. obsahu do mezibuň. prostoru)

ad 5) blok pozadí • nespecifickému vychytávání spec. Ab předcházíme vysycením tkáně bílkovinami (nespec. sérem nebo mlékem) – tkáň se saturuje „neškodnými“ bílkovinami a nespec. přibarvování pozadí je menší

ad 6 -8) vazba Ab a detekčního systému • reakce tkáň. Ag s primární – sekundární – terciární Ab = přítomnost chromogenu v místě, kde došlo ke spec. vazbě • reakce Ag-Ab nejlépe při neutrálním p. H • příbalový leták spec. Ab (fixovaná x zmražená tkáň, doporučené ředění…)

ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny • vazba Ag-Ab bez viditelné reakce! • pro využití světel. mikroskopu nutno vizualizovat = použití chromogenů – imunofluorescenční – imunoenzymové: peroxidáza • produkt činnosti peroxidázy je nerozpustný pigment

ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny • enzymatická reakce = vhodné podmínky (optimální teplota, p. H, iont. síla roztoku, poměr mezi enzymem a substrátem, nepřítomnost inhibitorů…) • peroxidáza + DAB = stabilní hnědý produkt, nerozpustný v alkoholu (nevyplaví se při dehydrataci řezů)

ad 10) dobarvování pozadí • orientace v preparátu – dobarvení jader hematoxylinem