Imunoglobuliny struktura Imunoglobuliny funkce Genetick zklad tvorby imunoglobulin
Imunoglobuliny – struktura Imunoglobuliny – funkce Genetický základ tvorby imunoglobulinů Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů I. (Ig. G, Ig. A) Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů II. (Ig. M, Ig. D, Ig. E) Izotypový přesmyk. Idiotypy a antiidiotypy - význam. Imunologická paměť Ontogeneze imunitní odpovědi Primární imunitní odpověď Sekundární imunitní odpověď. Efektorové funkce protilátek Simona Kaftanová
Struktura imunoglobulinů • 4 polypeptidové řetězce: 2 identické těžké (H) 2 identické lehké (L) H řetězce: μ, δ, γ, α, ε (rozdíly ve složení AK) L řetězce: κ, λ Izotypy = třídy Igg: Ig. M (μ) Ig. D (δ) Ig. G (γ) Ig. A (α) Ig. E (ε)
Struktura Ig - členění Dle štěpení enzymem papainem: • Fab-fragmenty – obsahují vazebné místo pro Ag • Fc-fragment - reaguje s Fcreceptory na buňkách těla Domény („oblasti“) na H i L řetězci: • variabilní (V) - formuje rozpoznávací část pro Ag • konstantní (C) - určuje sekundární biologické funkce Ig
Struktura Ig – vazebné místo pro Ag hypervariabilní úsek VL VH Paratop - vazebné místo pro Ag; reaguje specificky s epitopem Ag = oblast Ig tvořená hypervariabilními oblastmi VH a VL (hypervariabilní oblast – „špička“ variabilní oblasti s vysoce variabilním složením sekvencí AMK; určuje strukturu/specifitu vazebného místa pro Ag na základě složení sekvencí AMK, ale i morfologie a tvaru oblasti) Idiotop - jednotlivé unikátní struktury variabilní oblasti daného Ig (Ab); některé idiotopy mohou být totožné s vazebným místem pro antigen, jiné leží mimo paratop Idiotyp - suma všech idiotopů jedné Ig molekuly; společný identickým Ig molekulám
Antiidiotypové protilátky • tzv. protilátky 2. generace (idiotyp protilátek I. generace se chová jako antigen, tj. mohou proti němu vznikat Abb - antiidiotypové) • tvoří vnitřní obraz antigenu (některé antiidiotypové Abb mají vazebné místo, které se alespoň částečně podobá epitopu Ag, který vyvolal tvorbu Abb I. generace) • vyvolávají další tvorbu Abb proti sobě samým → antiidiotypové protilátky (protilátky 3. generace)→ vzniká idiotypová síť • regulační fce
Funkce Igg • obecně: – protilátky – Igg sekretované (solubilní) – antigenní receptor (BCR) - membránové Igg (Ig. M a Ig. D na povrchu B lymfo) • biologické vlastnosti jednotlivých izotypů Igg dány odlišnostmi v Hřetězcích resp. jejich konstantní částí resp. Fc-fragmentem: – při vazbě v IK váže C 1 → aktivuje komplement (klasická cesta) – reaguje s Fc-receptory na buňkách těla – určuje sekundární biologické aktivity izotypů Ig (př. biologický poločas, distribuci v těle a přechod přes placentu, schopnost opsonizace bakt. , vazba Ig. E na mastocyty apod. )
Izotyp Obsah Biolog. v séru poločas dospěl. (g/l) Ig. G (podtřídy Ig. G 1 -4 ) -monomer 8 -18 Tělesné tekutiny Funkce 21 dnů sérum, intersticiální opsonizace (hlavní opsonizující Ig) tekutina neutralizace aktivace komplementu (klasic. ) přestup placentou (jediný Ig) sekundární protilátková reakce (hlavní protilátka) Ig. A 0, 9 -3, 5 - sérový - slizniční (dimer + sekreční komponenta) 6 dnů sérum, slzy, sliny, povrch sliznic a jejich sekrety, mléko, pot ochrana sliznic (neutralizace) opsonizace Ig. M 0, 9 -2, 5 - pentamer - monomer (BCR) 6 dnů sérum, membrána B lymfo aktivace komplementu (klasic. ) primární protilátkové reakce (první a hlavní protilátka) při intrauterinní infekci produkovaná plodem receptor pro Ag (BCR) Ig. D -monomer 0, 1 3 dny sérum, membrána B lymfo receptor pro Ag (BCR) Ig. E -monomer 3 x 10 -4 2 dny sérum, interstic. t. , ochrana proti parazitům povrch mastocytů a atopická reakce bazofilů
Genetické základy tvorby imunoglobulinů Geny pro H-řetězec (14. chromozóm) • geny se člení do sekvenčních oblastí V, D, J, C (mezi nimi jsou dlouhé nekódující sekvence) – V (několik set – zajišťují variabilitu) – D (cca 50) – J (9) – C (kódují izotypy Ig - Cμ, Cγ, Cα, Cδ, Cε) Geny pro L-řetězec �(κ - 2. chromozom, λ - 22. chromozom) • struktura jednodušší – V, J, C
Proces rekombinace těžkého řetězce: a) nejprve tzv. D-J přeskupení částí genu, čímž se spojí náhodně určitý úsek D s některým úsekem J b) vyštěpení úseku mezi některým V a D-J; dochází k tzv. V-D přeskupení c) pokud vzniklý V-D-J produkt vyhovuje (= „dá se přečíst“), dojde k transkripci do m. RNA a sestřihu (k VDJ se připojí C sekvence pro sestavování AMK pro daný Ig) d) translace v protein, jehož struktura je kódována sekvencemi V, D, J, C
Proces rekombinace lehkého řetězce:
Tvorba Ig molekuly
Izotypový přesmyk • v průběhu imunitní odpovědi na Ag dochází u plazmocytů k přesmyku od tvorby Ig. M k produkci Ig. G nebo jiných tříd Ig • mechanismus: segment Cμ je vyštěpen a na jeho místo se dostane v pořadí další segment př. Cγ (produkce protilátek Ig. G) • směr přesmyku (volbu izotypu) regulují cytokiny - hlavně IL-4 (stimuluje produkci Ig. G 1, Ig. E), TGF-β, IL-10. . . • změna se týká konstantní domény H-řetězc; antigenní specifita je zachována
K velké diverzitě protilátek přispívají hlavně: • různost kombinací genových segmentů a následný sestřih • nepřesné spojování V, D a J a připojení náhodných segmentů • somatické mutace = mutace genů variabilní oblasti až po přeskupení a to v okamžiku setkání zralého B lymfocytu s Ag v lymfoidních foliklech (ponechány jsou mutanty s vysokou afinitou k Ag)
Imunitní reakce založené na protilátkách a) Primární imunitní odpověď (protilátková reakce při primární infekci): • probíhá ve dvou navazujících fázích – primární a sekundární • charakteristický vznik paměťových bb. a vysokoafinních Abb v procesu tzv. afinitní maturace b) Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí):
Primární imunitní odpověď – primární fáze: • první setkání B lymfo s Ag v sekund. lymf. org. → …viz Th 2 reakce… • vznik klonu mnoha dceřiných B lymfo s identickou nebo velmi podobnou specifitou → jejich diferenciace v plazmatické bb. (část B buněk se mění v paměťové bb. ) • část plazmatických bb. zpět do oběhu (do kostní dřeně aj. v organismu) • za 3 -4 dny od imunizace (primární infekce) plazmatické bb. vyprodukují množství Abb. • první se tvoří Ig. M s nízkou afinitou k Ag → účinné při blokování šíření infekce • Ig. M tvoří s Ag imunokomplexy (IK) → zachycovány v sekund. lymf. org. na povrchu tzv. folikulárních dendritických bb. (FDC) → IK mohou být skladovány na povrchu FDC či odstraňovány fagocytózou Výjimka: T-nezávislé Ag (hl. bakteriální polysacharidy) vyvolávají diferenciaci B lymfo na plazmatické bb. bez spolupráce s Th, př. aktivují B lymfo nespecificky tím, že se váží na receptory pro LPS, tj. nezávisle na specifitě)
Primární imunitní odpověď – sekundární fáze: a) změna afinity: Agg skladované v IK na FDC jsou rozeznávány B lymfo → další dělení a diferenciaci B lymfo (spolupráce Th 2) → mutace genů pro variabilní oblast Igg → vzniklé klony mají odlišná vazebná místa BCR a produkovaných Abb. než B lymfo z primární fáze → v soutěži o snižující se množství Ag uspějí B lymfo s nejvyšší afinitou k Ag (ostatní B bb. hynou) = proces afinitní maturace → vede ke vzniku Abb s několikanásobně vyšší afinitou než Ig. M z primární reakce („kvalitnější“ Abb) b) izotypový přesmyk (viz Genetika Igg): záměna těžkého řetězce μ (nevratné vyštěpení genové sekvence) původního Ig. M za jiný a následná tvorba odpovídajícího izotypu (Ig. G – druhý v pořadí nebo Ig. A, Ig. E, Ig. D) pod vlivem cytokinů (př. IL-4) za současného přímého kontaktu aktivovaných T lymfo s B lymfo (prostřednictvím adhezivní a kostimulační molekuly CD 40/CD 40 L) Pozn. po primární infekci dlouhou dobu přetrvává hladina Abb, které jsou schopné zabránit novému vzniku té samé infekce hned v počátku.
Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí): • rychlá aktivace paměťových bb. vzniklých při primární odpovědi → další zvýšení afinity Abb, počtu Abb a změny v izotypovém složení (Ig. G dosahuje dříve vyšší hodnoty) • potlačení infekce je rychlejší a účinnější
Imunologická paměť – část populace T a B-ly se po prvním setkání s Ag mění na paměťové buňky; jsou připraveny pro sekundární (anamnestická) odpověď, kdy jsou rychle aktivovány (vylepšují se vazebné schopnosti Abb k Ag – afinitu; rychlejší izotypový přesmyk)
Efektorové mechanismy působení protilátek: • neutralizace – Abb blokují aktivitu toxinů, virů a jiných mikroorg. tím, že se váží na kritické epitopy nutné pro toxické působení • inhibice adherence patogenů na buněčné povrchy – Abb navázané na patogen blokují jeho přichycení na slizniční povrchy (hl. fce s. Ig. A) • opsonizace – Abb navázané na Ag částici zlepšují či umožňují pohlcení této částice fagocyty či její napadení NK bb. (viz ADCC) • ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) – NK bb. mají receptor Fc. R pro Ig. G; je-li Ag opsonizován Ig. G a dojde k navázání Fc-Ig. G na Fc. R NK b. , aktivuje se degranulace NK b. na Ag • vazba Ab-Ag aktivuje komplement klasickou cestou → produkty komplementu přispívají k opsonizaci, chemotaxi fygocytů a rozvoji zánětlivé rce, k osmotické lýze cílových buněk
Ontogeneze imunitní odpovědi a/ prenatální vývoj • krvetvorba extraembryonální začíná ve 2. -3. týdnu gestace → postupně se krvetvorným orgánem stávají játra (celé intrauterinní období) → částečně se zapojuje i slezina → hlavní úlohu hematopoezy přejímá kostní dřeň (pokračuje postnatálně) • T-buňky - prekurzory postupují do thymu → diferenciaci do lymfoidních bb. , selekce. • B-buňky – syntéza specifických Ig. M již intrauterině, ale koncentrace prakticky neměřitelná (měřitelné konc. Ig. M při porodu = známka intrauterinní infekce) x Ig. G se začínají tvořit až po porodu. • zralé monocyty-makrofágy, neutrofily již ve fetální cirkulaci; neutrofily v menším počtu
Ontogeneze imunitní odpovědi b/ postnatální vývoj B lymfo: • po narození reakce na Ag podněty - hl. tvorba Ig. M (konc. srovnatelná s dospělými v 1. - 3. r. ) • tvorba Ig. G pozvolná a současně mizí mateřské Ig. G (největší pokles mezi 3. - 6. měs. → vyšší nemocnost) (konc. srovnatelná s dosp. mezi 10. -15. r. ) • protilátková reakce na polysacharidové antigeny (př. haemophilus) se objevuje až kolem 2. roku T lymfo : • po narození převážně naivní; nižší aktivita Tc, nižší funkce Th se normalizuje do 1 roku • vzestup Th 1 -reaktivity kulminuje na začátku dospělosti (zvýšený výskyt AI onem. ) nespecifická imunita novorozenců – funkčně méně zdatná
Ontogeneze imunitní odpovědi c/ stáří • snížená cytotoxicita NK-buněk a makrofágů • přesmyk od Th 1 k Th 2 • snížená protivirová a protinádorová imunita • nižší protilátková odpověď na nové podněty • vyšší produkce autoprotilátek
Monoklonální protilátky (m. Abb) • Abb produkované jedním určitým klonem plazmatických bb. (bb. odvozené od jednoho B lymfo) • identické molekuly (Abb jednoho izotypu a jedné specifity - variabilní část namířena jen proti jedné specifické části daného Ag) XXX Polyklonální protilátky (konvenční) • „směs“ monoklonálních protilátek • Abb namířené proti různým epitopům daného Ag • získávají se obvykle imunizací zvířat – tzv. antiséra
Monoklonální protilátky (m. Abb) Výskyt: a) nádor z plazmatických bb. (mnohočetný myelom, plazmocytom) b) produkt hybridonu (= in vitro výroba) Hybridon = b. získaná fúzí b. myelomu a slezinného lymfocytu myši imunizované příslušným Ag: – nádorová b. dodává hybridonu nesmrtelnost a schopnost produkce Abb jednoho izotypu – lymfocyt dodává specifitu vůči určitému Ag → spojením těchto bb. vzniknou kultivované hybridomy schopné uvolňovat m. Abb do kultivačního media Využití: m. Abb označené enzymy a fluorescenčními látkami atd. (= konjugát) → využití v labo dg. , tp. pozn. humanizované monoklon. Abb - metodou genetického inženýrství se zmodifikují molekuly tak, že z myší pocházejí jen vazebná místa, kdežto ostatní části protilátkové molekuly jsou kódované z lidských genů
Příprava monoklonálních Abb (m. Abb) slezinné lymfo z myši imunizované příslušným Ag buňky myelomu fúze myelomových bb. a slezinných lymfo selekce hybridomů a jejich další kultivace klonování hybridomů výběr vhodných hybridních klonů tvořících jen tu žádanou m. Ab
Příprava polyklonálních Abb
- Slides: 26