Imunochemick metody ada metod zaloench na principu reakce

Imunochemické metody • řada metod založených na principu reakce: antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK) • stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)

Vyšetřování parametrů humorální imunity

Vyšetřování humorální imunity • Elektroforéza • Imunodifůze • Nefelometrie • Turbidimetrie • Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; Ig. M, Ig. G) • Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement) • Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA) • Imunobloting (southerblot, notherbloting, westernbloting) • imunofluorescence

Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie Použití: – stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C 3 a C 4, C 1 INH) – používá se prostanovení vzorků o vyšších koncentracích proteinů

Nefelometrie Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab. Z – zdroj (laser, výbojka) K – kyveta se vzorkem D – detektor D ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D

Nefelometrie Vyhodnocení: dle kalibrační křivky sestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla intenzita odraženého světla koncentrace Ag

Turbidimetrie Princip: měří úbytek intenzity světla po jeho průchodu kyvetou obsahující IK Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce: Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D Vyhodnocení: dle kalibrační křivky

Radiální imunodifúze - jedna z nejstarších imunochemických metod (z větší části nahrazena zákalovými metodami) Princip: tvorba IK v agarózovém gelu obsahujícím Ab po difúzi Ag

Radiální imunodifúze Postup: gel + Ab → inkubace s Ag → Ag difunduje do okolí a tvoří s Ab imunokomplexy (IK) = prstencový precipitát Hodnocení: změří se průměr prstence a koncentrace Ag se odečítá na kalibrační křivce Použití principu RID: stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu, funkční test C 1 INH

EIA – enzyme immunoassay • skupina metod Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky (Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení) Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Abb, hormonů, cytokinů, TU markerů. . . )

EIA – enzyme immunoassay Dělení EIA metod: a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu: • ELISA (fotometrická detekce barevného produktu) • FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného produktu) • LEIA (luminometrická detekce světla uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu) b) dle postupu: • heterogenní x homogenní • kompetitivní x nekompetitivní

EIA – enzyme immunoassay Pozn: Heterogenní EIA: promývá se → odděluje se značená reagencie (Ag*, Ab*) vázaná v IK od volné (x homogenní se nepromývá) Př. kompetitivní EIA: Ab proti vyšetřovanému Ag je vázána na pevnou fázi (př. jamka destičky) → přidá se Ag (vyšetřovaný vzorek) a standardní množství značeného Ag*. Oba druhy antigenů soutěží o vazebné místo na zakotvené Ab → vzniknou IK (Ag-Ab, Ag* -Ab) → přidá se enzymový substrát → měříme výsledný produkt (př. zbarvení) (nepřímo úměrné množství hledaného Ag ve vzorku)

EIA – enzyme immunoassay ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay = heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevnatá (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je v konečné fázi vázán mezi dvěma vrstvami: Ab'-Ag-Ab* nebo Ag'-Ab-Ab* Princip: pevná fáze je pokryta př. Ab´ (proti danému epitopu hledanéhu Ag) → přidáme vzorek (hledaný Ag) → tvorba IK (Ab'-Ag) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ proti jinému epitopu hledaného Ag značená enzymem (Ab*) → vzniká komplex Ab'-Ag-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce (pokud proběhla předchozí reakce) → vznik barevného produktu

EIA – enzyme immunoassay Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky

C) EIA – enzyme immunoassay Pozn: FEIA – fluoroenzymoimunoanalýza - výsledkem reakce je fluorescující produkt hodnocení: dle kalibrační křivky! - fluorometr měří intenzitu fluorescence použití: př. stanovení specifických Ig. E LEIA – luminoenzymoimunoanalýza – výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu - způsobí uvolnění (emisi) hodnocení: dle kalibrační křivky! - luminometr měří intenzitu emitovaného světla použití: př. stanovování hladin specifických Ig. E, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.

D) RIA – radioimunoanalýza Princip: Ag nebo Ab se značí nuklidem (izotopem) (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK • vysoká citlivost a specifičnost • nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení, bezpečnost práce Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, . . .