Imunochemick metdy reakcie antignu s protiltkou srologick metdy

  • Slides: 17
Download presentation
Imunochemické metódy reakcie antigénu s protilátkou sérologické metódy, precipitačné metódy, enzýmové imunometódy, imunoanalýzy s

Imunochemické metódy reakcie antigénu s protilátkou sérologické metódy, precipitačné metódy, enzýmové imunometódy, imunoanalýzy s použitím častíc a v suchej fáze, imunoelektrometódy, imunoafinitné metódy, . . .

Imunochemické metódy • založené na reakcii antigén – protilátka • sily uplatňujúce sa pri

Imunochemické metódy • založené na reakcii antigén – protilátka • sily uplatňujúce sa pri väzbe – vodíkové väzby – hydrofóbne interakcie – Coulombove sily (elektrostatické interakcie) – van der Waalsove sily (Londonove disperzné sily) • väzba je reverzibilná a na silu interakcie má vplyv prostredie a afinita • rovnovážna asociačná konštanta

Detekcia imunokomplexu • voľným okom – precipitát (rozpustné antigény) – aglutinát (nerozpustné antigény, bunky,

Detekcia imunokomplexu • voľným okom – precipitát (rozpustné antigény) – aglutinát (nerozpustné antigény, bunky, . . . ) • po zafarbení precipitátu • optické metódy – turbidimetria – nefelometria • označenie jedného z reaktantov značkou – rádioizotopy 125 I, 3 H, 14 C, 75 Se (RIA) – enzýmy (EIA, ELISA) – fluorochrómy (FIA) – chemiluminofóry (CIA) – stabilné voľné radikály (SIA, FRAT) – častice (PHI, PACIA) – zlúčeniny kovov (MIA) – bakteriofágy (VIA)

Sérologické metódy kvapalné prostredie (metódy 1. generácie) • imunoprecipitácia Ag = precipitogén, Ab =

Sérologické metódy kvapalné prostredie (metódy 1. generácie) • imunoprecipitácia Ag = precipitogén, Ab = precipitín • imunoaglutinácia Ag = aglutinogén, Ab = aglutinín priama a nepriama (kvantifikácia podľa kompetície) hemaglutinačné metódy na erytrocytoch • metódy využívajúce väzbu komplementu veľmi citlivé, ale ťažko kvantifikovateľné skríningová diagnostika

Precipitačné metódy sérologické • kvantitatívna precipitácia • nefelometria – fluorescenčná, laserová • turbidimetria gélové

Precipitačné metódy sérologické • kvantitatívna precipitácia • nefelometria – fluorescenčná, laserová • turbidimetria gélové • imunodifúzne – Ouchterlony – rádiálna imunodifúzia (RID) • imunoelektroforetické – Grabar a Williams – imunoelektrodifúzia (raketová) – imunoelektrosyneréza (stretná) – dvojrozmerná (krížová) – imunofixácia po elektroforéze

Blottovacie metódy • Southern 1975 southern blot DNA na nitrocelulózu • Alvine 1977 northern

Blottovacie metódy • Southern 1975 southern blot DNA na nitrocelulózu • Alvine 1977 northern blot RNA na diazobenzoyloxymetylovaný papier • Burnette 1981 western blot proteíny na nitrocelulózu al. PVDF • dot immunobinding assay (DIBA) detekcia < 1 μg/ml Ig • Petri dish-Agar Dot Immunoenzymatic Assay (PADIA) ako DIBA, ale na PM a substrát je v agare • multianalyte immunoassay mikrospot 10 -50 μm 2 t. j. 106 proteínov na chipe identifikácia tenkým Xe laserom

Enzýmové imunoanalýzy • EIA, EMIT – homogénna (inhibícia enzýmovej aktivity – netreba oddeľovať IK)

Enzýmové imunoanalýzy • EIA, EMIT – homogénna (inhibícia enzýmovej aktivity – netreba oddeľovať IK) – heterogénna • ELISA – kompetitívna/nekompetitívna – priama/nepriama detekcia • ELISPOT – imobilizácia protilátky na membránu – saturácia – rast buniek + produkcia Ab, cytokínov, . . . – odmytie buniek – sendvičová ELISA

Enzýmové imunoanalýzy • CEDIA cloned enzyme donor immunoassay enzým (β-galaktozidáza) je rozdelený na 2

Enzýmové imunoanalýzy • CEDIA cloned enzyme donor immunoassay enzým (β-galaktozidáza) je rozdelený na 2 neaktívne fragmenty – enzýmový donor (5 % veľkosti enzýmu) – enzýmový akceptor (95 % veľkosti enzýmu) jeden z nich je naviazaný na antigén po väzbe na protilátku sa nemôže skompletizovať aktívny enzým (tetramér) v prítomnosti antigénu sa voľný antigén s fragmentom enzýmu spojí do funkčného enzýmu s druhou časťou a má enzýmovú aktivitu

Enzýmové imunoanalýzy • enzýmová imunochromatografia – strip s imobilizovanými protilátkami (Whatman 31 ET) –

Enzýmové imunoanalýzy • enzýmová imunochromatografia – strip s imobilizovanými protilátkami (Whatman 31 ET) – vzorka a haptén s naviazaným enzýmom sa nechajú vzlínať (GOD, haptén-peroxidáza) – detekcia enzýmovej aktivity (glukóza, 4 -chloro-1 -naftol) – výška farebnej zóny je priamo úmerná množstvu antigénu/hapténu vo vzorke žiadne vybavenie kvantitatívne rýchle (10 min) nezávislé na aktivite kompetícia

Rádioaktívne imunometódy • RIA rádioimunoanalýza (značený Ag, H) • IRMA imunorádiometrická analýza (značená Ab)

Rádioaktívne imunometódy • RIA rádioimunoanalýza (značený Ag, H) • IRMA imunorádiometrická analýza (značená Ab) Rosalyn Yalow 1977 Nobelova cena citlivosť v pg/ml (napr. prostaglandín F 2α) rádioizotopy: 125 I naviazaný na tyrozín použitie: detekcia užívania drog

Fluorescenčné a chemiluminiscenčné metódy • FIA fluorescence immunoassay ako EIA • FPIA fluorescence polarization

Fluorescenčné a chemiluminiscenčné metódy • FIA fluorescence immunoassay ako EIA • FPIA fluorescence polarization imunoassay Ag-fluoresceín (polarizované λex=490 nm λem=520 nm) IK rotuje pomalšie ako samotný Ag a tak emituje viac kompetícia bez separácia – robotizácia • fluorescence excitation transfer immunoassay Ag + (Ag-F)-(Ab-R) ↔ Ag-(Ab-R) + Ag-F Ag + Ab-F + Ab-R → (Ab-R)n-Ag-(Ab-F)m • PCFIA particle concentration FIA protilátky naviazané na častice a sendvič • zhášanie fluorescence quenching fluorescencia Ab je zhášaná po naviazaní Ag • CIA chemiluminiscence immunoassay vysoká citlivosť 10 -18 – 10 -21 mol

Problémy s fluorescenciou • autofluorescencia – sérové proteíny – bilirubín zvýšené pozadie resp. základná

Problémy s fluorescenciou • autofluorescencia – sérové proteíny – bilirubín zvýšené pozadie resp. základná línia • zhášanie fluorescencie – bilirubín – hemoglobín • photobleaching – pri dlhšom ožiarení fluorfóru slabne intenzita emitovaného žiarenia

Imunoanalýzy s použitím častíc • hemaglutinačné metódy – pasívna inhibícia hemolýzy • SPIA sol

Imunoanalýzy s použitím častíc • hemaglutinačné metódy – pasívna inhibícia hemolýzy • SPIA sol particle immunoassay častice zlata 50 μm (Au 50 -Ab) sú červené a po naviazaní antigénu sa odfarbia (Au 50 -Ab-Ag(H)) h. CG – vizuálne 170 pmol/L, kolorimetricky 5 pmol/L, atómová absorbčná spektrometria 0, 02 pmol/L • PACIA particle counting immunoassay počítanie neaglutinovaných častíc výhody nie je potrebná separácia rýchle relatívne citlivé

Imunoanalýzy v suchej fáze Požiadavky • všetky reagencie umiestniť do jedného zariadenia (prúžok papiera),

Imunoanalýzy v suchej fáze Požiadavky • všetky reagencie umiestniť do jedného zariadenia (prúžok papiera), ktorý sa aktivuje pridaním vzorky • jednoduchý merací prístroj (ak je vôbec potrebný) Príklady Homogénne imunoanalýzy bez separačných medzistupňov SLFIA substrate-labelled fluorescent immunoassay substrát s neaktívnym fluorochorom sa po naviazaní na Ab neštiepi, ale voľný sa štiepi enzýmom na aktívnu formu ARIS apoenzyme reactivation immunoassay system Ab proti liečivu, a. GOD, peroxidáza, glukóza konjugát liečivo-FAD, substrát

Imunoafinitné elektródy • antigénové (potiahnuté Ag) • protilátkové (potiahnuté Ab) Imunosenzory • piezoelektrické kryštálové

Imunoafinitné elektródy • antigénové (potiahnuté Ag) • protilátkové (potiahnuté Ab) Imunosenzory • piezoelektrické kryštálové (založené na zmene rezonančnej frekvencie piezoelektrických kryštálov po naviazaní protilátky) • založené na fluorescenčnej excitácii (svetlom cez svetlovod excitujeme fluorescenčný materiál naviazaný na protilátkach a tým istým svetlovodom zachýtávame signál) • s detekciou na báze surface plasmon resonance • s detekciou FRET • . . . a iné kontinuálne meranie viacnásobné použitie

DNA/RNA sondy • detekcia špecifických úsekov DNA/RNA • produkty PCR reakcií • Ab proti

DNA/RNA sondy • detekcia špecifických úsekov DNA/RNA • produkty PCR reakcií • Ab proti analógom nukleotidov, hapténom naviazaným na DNA sondu

Zvýšenie citlivosti • • • sekundárne protilátky enzýmy biotín-streptavidín použitie častíc (aglutinácia) alternatívne metódy

Zvýšenie citlivosti • • • sekundárne protilátky enzýmy biotín-streptavidín použitie častíc (aglutinácia) alternatívne metódy detekcie (AAS, fluorescencia, chemiluminiscencia. . . ) receptor ligand afinita lektín enzým protilátka glykoproteín substrát antigén 10 -3 – 10 -5 10 -3 – 10 -6 10 -7 – 10 -11 receptor avidín hormón biotín 10 -9 – 10 -11 10 -15