Immunohematologia Antygeny grup krwi Badanie przeciwcia Testy zgodnoci

Immunohematologia Antygeny grup krwi Badanie przeciwciał Testy zgodności przed przetoczeniem Przetaczanie krwi

Historia odkryć antygenów grupowych krwi Antygeny Odkrycie Układ rok Autorzy A B O MNS P Rh -Hr Kell Lewis Lutheran Duffy Kidd Diego Js 1900 1927 1937 1946 1950 1951 1954 1957 Landsteiner and Levin Landsteiner and Wiener Coombs, Mourant and Race Mourant Callender and Race Cutbush, Mollison and Parker Allen, Diamond and Niedziela Levine, Koch, Mc. Gee and Hill Giblett

Antygeny krwinek czerwonych charakteryzują następujące cechy: 1. Ich obecność stwierdza się na podstawie reakcji ze swoistym przeciwciałem. Wynikiem tej reakcji jest: aglutynacja (ag +ab) lub liza (ag+ab+C’) 2. Są one dziedziczone zgodnie z prawami Mendla 3. Ich ekspresja pojawia się w życiu płodowym, w pełni wykształca się po urodzeniu i wczesnym okresie noworodkowym, pozostaje do końca życia 4. Układ antygenów ABO jest jedynym, przeciwko któremu w surowicy i osoczu znajdują się regularne, naturalne przeciwciała przeciwko antygenom nieobecnym na własnych krwinkach

Podstawy genetyki • Geny strukturalne - zawiadują syntezą białek • Geny regulatory (hamujące, modyfikujące) - kontrolują ilość antygenu produkowanego przez geny strukturalne • Geny amorficzne – gen niemy (produkty nieznany) • Genotyp – to zespół genów odpowiedzialnych za syntezę cech • Fenotyp – to cechy, które można wykryć badaniami laboratoryjnymi

Podstawy genetyki Geny zajmujące jedno locus w chromosomie • geny alternatywne • geny alleliczne • allele Układ, w którym są dwa lub więcej alleli to układ polimorficzny Niezależnie od liczby allelicznych genów tylko jeden z nich może zająć odpowiednie locus w danym chromosomie Chromosomy dziedziczy się po jednym z każdej pary ( 22 pary u człowieka) Homozygota = dwa odpowiednie loci zajęte jest przez dwa identyczne allele (geny) Heterozygota = dwa odpowiednie loci zajęte przez różne allele Homozygota syntetyzuje antygen w podwójnej dawce Heterozygota syntetyzuje antygen w pojedynczej dawce Charakter genu może być : • dominujący • ustępujący (recesywny) • kodominujący (ekspresja genu ujawnia się zawsze)

Podstawy genetyki grup krwi Zasady genetyki grup krwi : 1. Antygeny wielocukrowe są budowane przy pomocy transferaz 2. Każdy swoisty cukier jest dodawany do określonego substratu 3. Włączenie nowego cukru odbywa się przy pomocy transferazy będącej pod nadzorem odpowiedniego genu 4. Powstanie antygenu przy pomocy transferazy musi być poprzedzone prawidłowym wykształceniem substratu 5. Niektóre transferazy mogą używać wiecej niż jednego substratu 6. Dodanie nowego cukru do substratu powoduje powstanie nowego antygenu, który maskuje poprzednio zbudowany antygen.

Podstawy genetyki grup krwi Układ ABO - układ polimorficzny Znane są 3 geny : A, B, i 0, niektórzy uważają że są 4 geny (A 1, A 2, B i 0) Transferaza A 1 różni się od transferazy A 2 niższą efektywnością. • Lokalizacja – długie ramię chromosomu 9 • Regulują syntezą transferazy glikozylowej, która dołącza specyficzny cukier do łańcucha oligosacharydowego • Różnice w genach A i B są punktowe, ( różnice dotyczą pojedynczej reszty cukrowej) są wynikiem różnicy w swoistości syntetyzowanej transferazy • Punktowa różnica w genie 0 powoduje syntezę białka bez aktywności enzymatycznej

Antygeny węglowodanowe grup krwi Prekursorowy łancuch H grupa krwi 0 L-fukoza N acetylogalaktozamina D-galaktoza Antygen A Grupa krwi A 1 lub A 2 Antygen B Grupa krwi B Antygen A i B Grupa krwi AB

Struktura polisacharydowego łancucha H typu I i typu II

Podstawy genetyki grup krwi Krwinki czerwone grupy 0 i A 2 mają duże ilości antygenu H. Gen H i jego allel h dziedziczą się niezależnie od genów ABO (nie są sprzężone) Gen H jest dominujący - gen h amorficzny. Brak genu H (genotyp h/h) zdarza się wyjątkowo rzadko i powoduje. brak łańcucha H (brak transferazy H ). Erytrocyty nosicieli tej cechy nie wykazują obecności antygenu układu AB jednak w ich krwi są obecne odpowiednie transferazy dla antygenu A i B Osoby takie posiadają grupę krwi Bombay (pseudo 0) Oznacza się ją odpowiednio : 0 h. A, 0 h. B, 0 h. AB ( Oh – Bombay lub ABHnull) Osoby te są bardzo trudnymi pacjentami w sytuacji konieczności przetoczenia krwi. Dawca musi być poszukiwany w grupie nosicieli takiego samego defektu. Dawca musi mieć taką samą rzadką grupę krwi.

Antygeny krwinek czerwonych w płynach ciała 80% ludzi rasy białej jest nosicielem genów, które determinują obecność antygenów krwinek czerwonych w płynach ciała (wydzielacze) swoistość tych antygenów to H, A, B and Le. • Geny regulujące wydzielanie mają dwa allele Se and se • Wydzielaczami są osoby z genotypem : Se. Se lub Sese • Gen Se zawiaduje syntezą fukozylotransferazy dołączajacej fukozę do łańcucha prekursorowego typu I. Powstaje łancuch H typu I • Genotyp sese charakteryzuje osoby nie wydzielające Jeśli • Erytrocyty są A+ - w płynach są antygeny H i A • Erytrocyty są B+ - w płynach są antygeny H i B • Erytrocyty są A+B+ - w płynach są antygeny H, A i B • Pozwala to na oznaczenie grupy krwi bez pobierania krwi (np. w ślinie) • Informacja ta jest ważna dla laboratoriów kryminalistycznych i jest wykorzystywana w identyfikacji podgrup i ustalaniu podłoża osób o nietypowej grupie krwi. •

Częstość fenotypu AB 0 w wybranych populacjach Populacja A 1 A 2 B A 1 B A 2 B 0 Niemiecka 32, 5 9, 4 11 3, 1 1, 1 42, 8 Polska 31, 5 9, 0 19 6, 4 1, 6 32, 5 Euro-Amerykanie 35 10 8 3 1 43 Pł. Am. Indianie 0 0 0 100 Aborygeni 55, 6 0 0 0 0 44, 4 Lapończycy 36, 1 18, 5 4, 8 6, 2 18, 2

Różna gęstość antygenu A na krwinkach grupy A 1 i A 2 A A A H A H

Antygeny węglowodanowe grup krwi Inne układy grupowe częstość w populacji 1. Układ Lewis : antygeny Lea and Leb - Lea 22%, Leb 72%, Lea-6% Przeciwciała anty Lewis są naturalne klasy Ig. M Dwie pary genów uczestniczą w budowie antygenów Lewis Le i le oraz Se i se. Geny le i se są amorficzne. Substratem dla tych antygenów jest łańcuch H typu I. Antygeny te są adsorbowane przez błonę krwinki z osocza Le/Le lub Le/le le/le Niewydzielacze se/se Le (a+ b-) Wydzielacze Se/Se lub Se/se Le (a- b+) (a-b-) Le (a- b-)

Antygeny węglowodanowe grup krwi Inne układy grupowe 2. Układ Ii lub IH ( słabe antygeny) Krwinki płodu i pępowiny reagują słabo z przeciwciałem anty-I i silnie z anty-i. Antygeny tego układu pojawiają się dopiero w 2 roku życia Anty-I (IH) przeciwciała są klasy Ig. M zimnymi aglutyninami. Pacjenci chorujący na mononukleozę lub zapalenia płuc wywołane mycoplasmą mają wysokie miano zimnych aglutynin ze swoistością anty I lub anty i, które są odpowiedzialne za rozwój autoimmunologicznej anemii hemolitycznej 3. P system: częstość - P 1 - 79%, P 2 amorficzny – 21% (brak. P 1), P 1 - determinuje D-galaktoza w łańcuchu H typu II (bez fukozy) Przeciwciała anty P 1 są przeciwciałami naturalnymi (Ig. M)

Antygeny białkowe grup krwi Układ antygenów częstość w populacji • 1. Kidd (Jk aand Jkb) Ab. odpornościowe - Jka 25%, Jkab 50%, Jkb 25% • 2. Duffy ( Fya Fyb) Ab. odpornościowe - Fya 17%, Fyab 49%, Fyb 34% Ag Duffy jest receptorem dla Zach. Afryka -70% Duffy minus zarodźca malarii (Plasmodium vivax) Rasa Kaukaska –większość Duffy positive • 3. Kell (Kk) ab odpornościowe - K 10%, k 90% (K+, k = K- ) • 4. MNS Przeciwciała naturalne Ig. M - M 35%, MN, 48%, Anty s zawsze odpornościowe N 16%, S 10%, Ss 44%, s 45% • 5. Rh

Układ Kell. Geny kodujace antygen k i K sa kodominujace. Przeciwciala anty Kell ( anty k i anty K ) maja podobne dzialanie jak anty Rh D z ukladu Rh. Mogą być przyczyną konfliktu pomiedzy matka i płodem i są przyczyną odczynow poprzetoczeniwych. 10% osób rasy kaukaskiej jest K+ 2% afroamerykanów jest K+ Zgodnie z obowiazującymi przepisami dziewczynkom i kobietom do okresu menopauzy wolno przetaczać krew zgodną w ukladzie KELL ( K- dla K-)

Sprzężenie genów kodujących syntezę antygenów MNS

Układ Rh Układ antygenów Rh jest złożony Istnieje różna terminologia Amerykańska Wiener’a Angielska Fisher’a-Race, a Rh-hr CDE-cde Chromosom Ag czynnik Ab Chromosome Ag Ab krwi pojedynczy Rh 1 Rho anti-Rho silnie D D anti- D gen R 1 rh’ anti-rh’ sprzężone C C anti- C rh’’ anti-rh” geny E E anti-E

Układ Rh Wiener Fisher-Race Gen Ag cz. krwi Gen Ag r rh hr’ i rh” cde c, d, e r’ rh’ i hr” Rh - Cde C, d, e r” rh”i hr’ (minus) cd. E c, d, E ry rh’ i rh’’ Cd. E C, d, E R 0 Rho, hr’ i hr” c. De c, D, e R 1 Rho, rh’ i hr’’ Rh+ CDe C, D, e R 2 Rho, rh” i hr’ (plus) c. DE e, D, C Rz Rho, rh” i rh” CDE C, D, E Ważne Rho = D = Rh+ (plus) = 80% populacji

Dziedziczenie antygenu Rh. D (Rh+) zależnosci od genotypu ojca matka ma genotyp d/d (Rh-)

Przykład różnic w budowie antygenu Rh. D wyjaśnia dlaczego osoba Rh. D+ może mieć przeciwciała anty D

Przykład tłumienia ekspresji antygenu RD przez gen C kodujący antygen Rh. C

Oznaczanie antygenów układu ABO sprawdzanie odczynników Surowica kontrolna Krwinki anty A anty B kontrolne 0 A B

Oznaczanie antygenów ABO próba właściwa z krwinkami i surowicą pacjenta Pacjent Surowica kontrolna Kontrolne krwinki nr anty A anty B 0 A B Dolichotest Wynik 123 0 345 A 1A 2 234 367 Krwinki pacjenta Surowica pacjenta B AB

Badanie Rh ( antygen białkowy) – 1. kontrola odczynników • Kontrola pozytywna surowica RBCs anty-D O Rh + • Kontrola negatywna surowica RBCs anty-D O Rh - Odczyt po 1 min (RUM) lub po 15 min (BLEND) inkubacji w temp. Pokojowej i po odwirowaniu 1 min 1800 obr/min Wynik: Aglutynacja RBCs Brak aglutynacji RBCs

Ocena Rh próba własciwa kontrola pacjenta może być pozytywna (+) lub powinna być negatywna (-) surowica anty-D krwinki pacjenta surowica pacjenta krwinki pacjenta 1 min inkubacja (RUM) lub 15 min (BLEND) temp. pokojowa wirowanie 1 min. 1800 obr. /min. odczyt wynik: aglutynacja znaczy erytocyty Rh+ brak aglutynacji znaczy Rh - erytrocyty nie powinny aglutynować jeśli jest aglutynacja - diagnozować chorobę autoimmunologiczną

Oznaczanie przeciwciał definicje Przeciwciała kompletne - zawsze klasy Ig. M najczęściej są to ab naturalne zimne ab - reagują z antygenem w temp. pokojowej regularne ab -anty-A lub anty-B nieregularne ab- Ig. M ab anty inne antygeny np. : H, Le, K Silnie aglutynują krwinki czerwone ponieważ mają budowę pentameru, wielkość cząsteczki pozwala na łączenie kilku krwinek Przeciwciała niekompletne klasy Ig. G nie aglutynują krwinek bezpośrednio tylko opłaszczają błonę krwinek ab odpornościowe – powstają w wyniku kontaktu z ag ciepłe ab – optymalna reakcja z antygenem w środowisku z białkiem i temp. 370 C

Aglutynacja krwinek z ab klasy Ig. M + = Ab kompletne anty -x krwinki z ag x Reakcja Ag - Ab =aglutynacja (Ig. M)

Wpływ buforu o niskiej sile jonowej (LISS low ionic strength solution) na aglutnację krwinek ab anty Ig. G

Schemat bezposredniego i pośredniego testu Coombsa Reakcja pomiedzy ab Ig. M anty X z ag X na krwinkach i ab Ig. G anty X i ag X na krwinkach anty Ig. G Ab klasy Ig. G anty. X Ab klasy Ig. M anty X

Bezpośredni test antylobulinowy (BTA) Bezpośredni test Coombsa Krwinki oplaszczone swoistymi przeciwciałami klasy Ig. G (czarne Y) aglutynują przeciwciała anty Ig. G ( białe Y – surowica Coombsa)

Pośredni test antyglobulinowy (PTA) 1. inkubacja krwinek z badaną surowicą 2. odpłukanie 3. dodanie do krwinek ab anty. Ig. G

Badanie obecności przeciwciał testami antyglobulinowymi 1. Cząsteczki Ig. G są małe, niezdolne do spowodowania aglutynacji , ale po rozpoznaniu swoistego antygenu wiążą się trwale z błoną krwinek 2. Do wywołania aglutynacji krwinek opłaszczonych abs Ig. G muszą być dodane abs rozpoznające anty ludzkie Ig. G ( surowica Coombsa) Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) – jednostopniowa procedura 1. ab anty ludzkie Ig. G jest dodane do badanych krwinek Wynik: aglutynacja oznacza - krwinki były opłaszczone przez abs brak aglutynacji oznacza – krwinki nie były opłaszczone abs Pośredni test antyglobulinowy (PTA) – dwustopniowa procedura 1. krwinki są dodawane do badanej serowicy - inkubacja, płukanie 2. Ab anty- ludzkie Ig. G jest dodawane do krwinek Wynik: aglutynacja znaczy - w badanej surowicy były abs przewiwko antygenowi na krwinkach brak aglutynacji znaczy – w surowicy badanej nie było abs.

Poszukiwanie przeciwciał w surowicy Testy antyglobulinowe są stosowane : 1. do oceny zgodności krwi biorcy i dawcy przed transfuzją 2. do rozpoznania anemii hemolitycznej noworodków 3. do oceny niekompletnych auto-przeciwciał w anemii autoimmunologicznej 4. do badań przesiewowych np. : surowic ciężarnych i dawców krwi 5. do identyfikacji swoistości przeciwciał znalezionych w badaniach przesiewowych 6. do określenia antygenów innych układów grup krwi np. : Duffy, Kell i innych

Aktywowane komponenty dopełniacza C 3 przyłączone do receptora C 3 na krwinkach aglutynują je w obecności ab anty Ig. G

Próba zgodności Proba zgodności obejmuje: • próbę własciwą • kontrolę własną biorcy • kontrolę dodatanią • kontrolę ujemną Do testu stosuje się metodą LEN tzn. : krwinki zawieszone są w LISS i traktowane enzymem papainą.

Próba zgodności Etap 1: - do 4 probowek dodać 1 kroplę buforu LISS zmiesznego z papainą w stosunku 2: 1 - do probowki nr 1 dodać 2 krople krwinek dawcy - do probowki nr 2 „ „ „ biorcy - do probowek nr 3 i 4 „ „ „ wzorcowych Rh+ INKUBACJA 10 min w 37 st. C Etap 2 : - do probowek nr 1 i 2 dodać po 2 krople surowicy biorcy - do probówki nr 3 dodać 2 krople surowicy anty D - do probowki nr 4 dodać surowicę anty AB INKUBACJA 3 -5 min w 37 st. C WIROWANIE w 1000 obr/min ODCZYT PO lekkim wstrząśnieniu

Próba zgodności – schemat (zawsze z krwią zgodną w ukladzie ABO) Nr LISS + Enzym Krwinki =LEN Surowica Aglutynacja 1 1 kropla Dawcy Biorcy Jeśli brak to zgodna 2 1 kropla Biorcy brak 3 1 kropla Wzorcowe Rh+ (plus) Anty D +++ Silna 4 1 kropla Wzorcowe Rh + ( plus) Grupy AB Brak Taki wynik upoważnia do przetoczenia, jeśli jest aglutynacja w probowce 1 trzeba zidentyfikować swoistość przeciwciał. Jeśli jest aglutynacja w probowce 2 lub 4 test nieudany technicznie.

Poszukiwanie przeciwciał w surowicy z zastosowaniem krwinek wzorcowych • Krwinki wzorcowe są zawsze grupy O: • zestaw 14, data ważności 24. 04 • 1. dccee Kk Fy(a+b+) Jk(a+b-) MNSs. P 1 Le(a-b+} • 2. Dccee kk. Fy(a+b-) Jk(a-b+) ss. P 1 Le(a-b+) • 3. Dcc. Ee Kk Fy(a+b+) Jk)a+b+) MMSs. P 1 Le(a-b+) • zestaw 15, data ważności 31. 04 04 • 1. Dccee Kk Fy(a+b-) Jk(a+b-) NN ss P 2 Le(a-b-) • 2. DCc. Ee KK Fy(a+b+) Jk((a+b-) MMSs. P 1 Le(a+b-)

Próba zgodności – Ważne !!! WYNIK PRÓBY ZGODNOŚCI WAŻNY 48 GODZIN Krew po wykonanej próbie musi być przechowywana w laboratorium przez 5 dni

Postępowanie w przypadku podejrzenia o ostry odczyn poprzetoczeniowy • 1. Natychmiast przerwać transfuzję i zawiadomić lekarza odpowiedzialnego za zabieg • 2. Utrzymać wkłucie dożylne , przetaczać 0, 9% roztwór Na. Cl do wdrożenia właściwego leczenia • 3. W celu wykluczenia błędu w dokumentacji sprawdzić: - dane na pojemniku z krwia - wynik próby zgodności - dane identyfikujące pacjenta • 4. Niezwłocznie zawiadomić Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa o wystąpieniu poprzetoczeniowego odczynu hemolitycznego • 5. Przesłać tam : - świeżo pobrane z innej żyły 15 ml krwi z antykoagulantem • - pojemnik z pozostałą krwia toczoną • - próbki krwi chorego z których wykonano badania zgodności • - świeżo pobraną próbkę moczu