IMMUNOHEMATOLOGI Dr HERU SETIAWAN IMUNOHEMATOLOGI Cabang Ilmu Patologi

IMMUNOHEMATOLOGI Dr HERU SETIAWAN

IMUNOHEMATOLOGI Cabang Ilmu Patologi Klinik yg mempelajari penggunaan teknik imunologik untuk mendeteksi kelainan-kelainan hematologik, al: 1. Reaksi transfusi hemolitik 2. Reaksi hemolitik pd bayi yang baru lahir (HDN=Hemolytic Disease of the Newborn) 3. Reaksi hemolitik pd AIHA (Auto Immuno Hemolytic Anemia) 2

§ Pemeriksaan laboratorium yg sering dilakukan untuk kepentingan klinis adalah : 1. Deteksi Antigen (Ag) gol darah ABO & Rhesus (Rh) 2. Tes pretransfusi : Cross matching test reaksi silang Mayor & Minor 3. Deteksi antibodi (Ab) Coomb’s test (Test Anti Globulin)

Reaksi transfusi hemolitik HDN Gol drh ABO Gol drh Rh AIHA Coomb’s test Reaksi silang

Pendahuluan n Normal: mengalami hemolisis • Jutaan eritrosit diproduksi tiap menit, umur 120 hari • Eritrosit tua, ‘mati’: dibersihkan dihancurkan oleh SRE (limpa) n Abnormal: hemolisis • Penyebab hemolisis: sebagian besar krn adanya antibodi • Tipe hemolisis : destruksi/kerusakan imun • Tjd pd reaksi transfusi, hemolytic disease of the newborn (HDN), autoimmune hemolytic disease (AIHA)

Pendahuluan n >> reaksi transfusi hemolitik disebabkan krn kerja antibodi (dlm serum pasien) spesifik berinteraksi dg antigen donor Dasar-dasar imunologi

Pendahuluan Dasar imunologi n n n n Eritrosit mengekspresikan antigen (Ag) (glikoprotein) di permukaan sel eritrosit, Ag tsb disebut Aglutinogen bersifat imunogenik Antigen A : golongan darah A Antigen B : golongan darah B Tidak mengekspresikan Ag A & B : gol O Normal seseorang membentuk aglutinin thd Antigen yg “ tidak dimiliki “ oleh eritrosit didlm tubuhnya sendiri Antibodi (Ab) dlm serum (Aglutinin): anti A, Anti B

Macam-macam antibodi (Ab) 1. Ab natural dan Ab imun Ab natural : merupakan Ig. M, timbul sbg akibat rangsangan bahan alami yg menyerupai Ag A/B (berasal dr bakteri/makanan atau produk bakteri) yg masuk tubuh, terbentuk ssdh umur 6 bln. Ab imun (Allo Ab) : merupakan Ig. G thd Ag pada individu dgn genetik berbeda ttp spesies sama, o. k masuknya Ag A dan/atau B kedlm tubuh melalui sirkulasi darah (transfusi, placenta) atau pemaparan thd produk darah

2. Complete Ab dan incomplete Ab Complete Antibody : Antibodi yg mampu menyebabkan aglutinasi langsung ( direk ) eritrosit-eritrosit yg tersuspensi di dalam salin (Ig M) Incomplete Antibody : Antibodi yg tidak mempunyai kemampuan untuk menyebabkan aglutinasi secara langsung dari eritrosit-eritrosit tsb tanpa penambahan fase antiglobulin (Ig G)

3. Ab tipe hangat ( Warm ) & Ab tipe dingin ( Cold ) Ab tipe warm : bereaksi lebih cepat pd 370 C (Ig. G) Ab tipe cold : bereaksi lebih cepat pd 200 C (Ig. M)

Alur uji laboratorium pre-transfusi Pasien a. Serum b. Eritrosit Buat suspensi eritosit 1. 5% dlm salin 2. 10% dlm salin 3. 40% dlm salin a/ serum Donor Buat suspensi eritosit 1. 5% dlm salin 2. 10% dlm salin 3. 40% dlm salin a/ serum Reaksi silang ABO Rh c. Pem gol ABO, Rh – metode slide, jika hasil OK: d. Reaksi silang Merup tes Coombs indirek MAYOR Fase III MINOR Fase III e. CCC Minor + : sebab? - Ab donor ? - Ab melapisi eritr pasien ? Cek dg tes Coombs Direk

Golongan darah n n Tipe gol drh ditentukan oleh ekspresi antigen di permukaan eritrosit (Antigen A, B, H) Ditemukan I x oleh Landsteiner th 1900 (Golongan A, B, O) Golongan AB ditemukan oleh Von Decastello & Sturli (1902) Identifikasi gol drh ditentukan dg melihat reaksi aglutinasi antara Ag & Ab

Substansi H n n n Constantoulakis menemukan substansi H pd sel fetus dari semua golongan ABO (ada sejak lahir) Substansi H berguna untuk pembentukan antigen A, B dan H pd eritrosit Pembentukan Ag A, B dan H tsb ditentukan oleh interaksi gen ABO dan Hh Substansi H merup struktur dasar Ag A & B Bila tdp gen H pd prekursor substance mk akan diubah mjd substansi H bila ada gen A / B mk akan mjd Ag A atau B

Substansi H n n n Shg seseorang dg gol A akan memp Ag A & H Gol B : memp Ag B & H Gen O, tak ada produk yg dpt dideteksi pd sel Gol O, tak ada substansi H yg diubah, hanya ditemukan substansi H saja Substansi H pada gol A & B < gol O Pd subgrup A, tak banyak substansi H yg diubah mjd Ag A bila reaksi thd Ag A menurun pd subgrup A yg lemah mk reaksi dg H mjd meningkat

Formasi antigen ABH n Gen ABH tdk langsung nyata mengkode produksi antigen ABH, tp memproduksi ensim spesifik glycosyltransferase yg bertugas menambahkan gula-gula ke substansi prekursor (PS) dasar pd eritrosit n Ag ABH dibentuk dr material prekursor dasar yg sama yang memp gycolipid backbone n Tdp satu struktur molekul karbohidrat (KH) yang melekat pd backbone tsb paragloboside/rantai oligosakarida/substansi prekursor n Formasi Ag ABH tergantung pd gula-gula yg ditambahkan n Monosakarida terakhir (nukleotida) / gula-gula yg menempel pada rantai KH menentukan spesifisitas molekul

Ensim & gula-gula yang berperan dlm penyusunan antigen ABH Gene Glycosyltransferase (enzyme) Immunodominant Sugar Antigen H -2 -L-fucosyltransferase L-fucose H A -3 -Nacetylgalactosaminyl transferase N-acetyl-Dgalactosamin A D-galactose B B -3 -Dgalactocylltransferase

menent spesifisitas Material dasar: • Galactose (GAL) • N-Acetylglucosamine (GLNAC) • Galactose (GAL) • Glucose (GL) Menyusun : Paragloboside a/ Oligosaccharide chain a/ Precursor substance Red blood cell precursor structure (which represents a paragloboside)

Gen H mengkode produkasi ensim L-fucocyltransferase Ensim tsb menempelkan Gula FUCOSE ke GAL Menyusun Antigen H Diekspresikan di permukaan eritrosit Gol O

Formasi antigen A Gen A mengkode produksi ensim N-Acetylgalactosaminyl transferase Ensim tsb menempelkan Gula N-acetyl-D-galactosamine (GALNAC) ke struktur H Menyusun Antigen A Diekspresikan di permukaan eritrosit Gol A

Formasi antigen B Gen B mengkode produksi ensim D-galactocyl transferase Ensim tsb menempelkan Gula D-galactose (GAL) ke struktur H Menyusun Antigen B Diekspresikan di permukaan eritrosit Gol B

Golongan A Golongan B Y Y Y A H H B A Y Y Anti B Antigen/aglutinogen A Antigen/aglutinogen B Y Y B Anti A Anti/aglutinin B

Golongan AB Golongan O Y A B H AB Y - H - O - Y Anti B Antigen/aglutinogen A Antigen/aglutinogen B Y Y Anti/aglutinin A Anti/aglutinin B Anti A

Golongan darah Genotipe Gen A AA atau AO Homozygot B Imunologi Memp Ag A & H Memp Anti B Heterozygot BB Atau BO Homozygot Memp Ag B & H Memp Anti A Heterozygot AB AB Heterozygot Memp Ag A, Ag B, Ag H Tidak punya anti O OO Homozygot Memp Ag H Tdk punya Ag A & B Memp Anti A Memp Anti B Bombay hh Homozygot Tdk memp Ag H, A & B Memp anti A, anti B, & anti H

Phenotype A dpt dibagi menjadi sub group : Sub grup dlm sistem ABO : ± 80 % group A : ph A 1 ± 20 % group A : ph A 2 A 1 & A 2 Kualitatif dan Kuantitatif berbeda A 2 : bereaksi lemah, kdg 2 terdeteksi sbg Gol O A 2 B : bereaksi lemah, kdg 2 terdeteksi sbg Gol B Antigen (Ag) yg termasuk sistem gol AB terdapat dlm : - eritrosit, endotel & epitel - cairan tubuh (mis : saliva) : glikoprotein

Suami istri homozygot Suami A A Istri B AB AB Anak Semua Gol AB 100% Suami heterozygot A Istri homozygot B Suami A O Anak Suami istri heterozygot Suami A O Anak Istri B AB BO O AO OO Bisa A, B, O, AB Prob ms 25% Suami homozygot A Istri heterozygot B Suami A A Anak Istri B AB BO Bisa B a/ AB Prob. 50: 50 B AB AB O AO AO Bisa A a/ AB Prob. 50: 50

Suami heterozygot A Istri heterozygot A Suami Istri A O A AA AO O Anak A 75% O 25% Suami homozygot O Istri homozygot O Suami Istri O AO OO Suami homozygot B Istri homozygot O Anak O B B BO BO Anak 100% B Suami heterozygot AB Istri homozygot O Suami A B Anak Istri OO OO OO 100% O O AO AO BO BO 50% A 50% B

Golongan darah Bombay n n n n Darah Bombay adalah homozygot hh Jarang >> 99, 9% individu : HH atau Hh Pertama kali ditemukan oleh Bhende di Bombay (1952) Dicurigai adanya darah yg tidak diaglutinasi oleh anti-A, anti-B, anti-AB dan anti-H Dituliskan sebagai golongan darah Oh untuk menunjukkan tidak adanya substansi H Gen h tidak memproduksi L-fucocyltransferase Memp Anti-A, anti-B, & anti-H

Seorang yang tidak mengekspresikan gen H (disbt juga genotype-nya hh) memp phenotype Bombay (Oh) tidak memproduksi substrat H gen A & B juga tdk bisa diekspresikan shg juga tidak mampu memproduksi Ag A dan Ag B

Perbedaan gol drh Oh dan O biasa Gol Oh/ Bombay O Anti A Anti B Anti AB Anti H Sel A 1 Sel A 2 Sel B Sel O - - + + -

Golongan BOMBAY Y Y h Y BOMBAY Anti B Y Anti A Anti/aglutinin H

Aglutinasi eritrosit oleh adanya reaksi antigen-antibodi ada 2 tahap : 1. Tahap Sensitisasi 2. Tahap Hemaglutinasi Lisis eritrosit terjadi bila seluruh rangkaian sistem komplemen teraktifkan menyertai interaksi Ag-Ab Aglutinasi terjadi bila Ab yg terikat menghubungkan eritrosit yg berdekatan membentuk gumpalan

Reaksi aglutinasi Golongan B Anti-B B Y Y B B B Y Anti A Y B + Anti-B B Anti-B Hemaglutinasi = reaksi positif Anti-B

Reaksi aglutinasi Anti-A Y Y Golongan O Anti A H O - - Anti B O Anti A Anti B Anti-AB Y Anti-B O + Anti-A O Tdk tjd hemaglutinasi = reaksi negatif

Reaksi penggolongan darah Eritrosit pasien Reaksi dg anti-A dg anti-B Reaksi dg anti-AB Interpretasi 1 Negatif O 2 + Negatif + A 3 Negatif + + B 4 + + + AB

ANTIGLOBULIN TEST ( COOMBS TEST ) Definisi : Tes utk mendeteksi adanya antibodi tidak sempurna (incomplete antibody) yang diabsorpsi oleh eritrosit dengan jalan mereaksikan anti Ig G dan anti komplemen dengan eritrosit yg sudah tersensitisasi terjadi hemaglutinasi Serum Coombs : Serum kelinci yg telah diimunisasi dg fraksi globulin/Ig G manusia, sehingga disebut juga Serum Anti Globulin

Pembuatan serum Coombs: • Serum manusia disuntikkan ke kelinci • Kelinci membuat Ab thd serum mns yg disuntikkan, disebut Rabbit Antihuman globulin = serum Coombs Digunakan dlm Tes Coombs / Uji Antiglobulin

n Direct Coomb’s Test Indikasi : untuk diagnosis n HDN ( Hemolytic Disease of the Newborn ) n AIHA ( Autoimmune Hemolytic Anemia ) n Reaksi transfusi hemolytik n Drug Induced Hemolytic Anemia n Indirect Coomb’s Test Indikasi : n Skrining Antibodi Deteksi Ab Ig. G; Ig. G anti Rh (D), lain 2 Ig G n Deteksi thd variant Rh yg bereaksi lemah, Ag Kell & Duffy n Pada keadaan hipo/a- gamaglobuliemia/agamaglobulinemia n Pada cross matching (reaksi silang)

Direct Antiglobulin Test ( Direct Coombs Test ) Untuk mendeteksi incomplete antibody yg melapisi eritrosit penderita in vivo Cara : Ø Eritrosit penderita dicuci dengan salin untuk menghilangkan globulin plasma yang tidak bersifat antibodi spesifik Ø Campur dengan serum Coombs tambahkan pada antibodi spesifik “incomplete“ yg diabsorbsi /melapisi eritrosit in vivo

DIRECT ANTIGLOBULIN TEST (DAT)/Direct Coombs Test Untuk mendeteksi incomplete antibody yg melapisi eritrosit penderita in vivo Ag Incompl Ab E + Serum Coombs hemaglutinasi

Indirek Antiglobulin Test / IAT ( Indirect Coombs Test ) Untuk mendeteksi incomplete antibody Ig G incomplete yang terdapat didalam serum penderita : Cara : § Eritrosit normal dari golongan darah yg sama atau gol darah O disuspensikan ke dalam serum penderita dan diinkubasikan pada 370 C § Sesudah dicuci dengan salin, tambahkan serum Coombs, disentrifus 1 menit pada 1000 rpm agglutinasi serum penderita mengandung antibodi tsb positif

IAT Ab dlm serum Ag E E Inkubasi 37° C 1 2 Sentrifus 1000 rpm (1 menit) Cuci dg salin + Serum Coombs hemaglutinasi 3 4

Kd tes Coombs menghasilkan hasil NEGATIF PALSU, sebab: Pencucian eritrosit seblm pe + an serum Coombs kurang sempurna, msh tdp sisa globulin yg menetralkan serum Coombs 2. Salin terkontaminasi oleh protein/globulin 3. Lupa menambahkan serum Coombs 1. Diperlukan Coombs Control Cells (CCC)

Sistim Rhesus n n n n Sampai saat ini dikenal 6 Ag: C & c, D & d, E & e Kombinasi: CDe, c. DE, c. De, CDE, cd. E, Cd. E, cde, Cde (terbanyak CDE, cde) Hasil: Rhesus + & Rhesus – Yang menentukan + a/ - adalah: ada tidaknya antigen D Berguna dalam klinik Rhesus - : >> orang kulit putih Indonesia: <<

Golongan Darah Rhesus ( Rh ) D + : gol darah Rh +, mempunyai Ag D n D - : gol darah Rh - , genotipe cde/cde, tdk mempunyai Ag D, mampu membentuk Anti D bila terjadi pemaparan dg eritrosit Rh + n Du : Rh + lemah, bereaksi lambat, sering keliru dengan Dn

Reaksi silang (Crossmatch) n n Merupakan bagian dari tes kompatibilitas Tes kompatibilitas mengandung: n 1. Review riwayat blood bank pasien & catatan pasien sebelumnya (transfusi, kehamilan) n 2. Penggolongan drh ABO & Rh n 3. Skrining antibodi n 4. Reaksi silang

Kegunaan reaksi silang n n Cek final kompatibilitas ABO antar donor & pasien Mendeteksi antibodi dlm serum penderita yg akan bereaksi dg Ag donor, yg tak terdeteksi dg tes skrining Ab

Reaksi silang terdiri atas 2 macam : Reaksi Mayor : reaksi antara eritrosit donor dengan serum resipien Reaksi Minor : reaksi antara eritrosit resipien dengan serum donor Eritrosit Serum Eritrosit - MINOR Serum MAYOR - Resipien Donor

3 fase reaksi silang n Fase I : Fase suhu kamar dalam medium salin n n serum + suspensi sel dlm salin Suhu kamar 250 C Tahap penggolongan darah & deteksi complete Ab adanya cold autoagglutinin/auto-Ab tipe dingin adanya cold alloagglutinin/allo-Ab tipe dingin (anti A 1, anti M, anti P 1, anti Lewis dll)

n Fase II : Fase inkubasi 37°C • • Tahap Rh grouping Incomplete Ab akan tersensitisasi Keseimbangan ikatan Ag-Ab berlangsung beb saat (15 -60 memit) Inkubasi terlalu lama : sensitisasi melemah Inkubasi dlm Bovine Albumin 22% hanya 15 menit Kd incomplete Ab sistim Rh dpt terdeteksi (anti-D, anti -C, anti-E), tampak reaksi aglutinasi incomplete Ab lain spt K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb hanya tersensitisasi saja, tampak aglutinasi jika di + reagen Antiglobulin

n Fase III : Fase Antiglobulin • • • Mendeteksi incomplete Ab yg sudah melapisi eritrosit Sel pd fase II dicuci, kmd di + serum Coombs = Tes Coombs/Antiglobulin Indirek

Minor + : sebab? - Ab donor ? - Ab melapisi eritr pasien ? Cek dg tes Coombs Direk negatif Ab donor positif Ab yg melapisi eritrosit pasien: • AIHA • HDN • transfusi sebelumnya