IMMOBILIZLS Mikroorganizmusok sejtek enzimek felleti rgztse hordozn polimerekbe

IMMOBILIZÁLÁS Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek felületi rögzítése hordozón polimerekbe zárása keresztkötése

Immobilizáció • a sejtek kötődésének vagy bezárásának különböző formáit összefoglaló fogalom • A természetben gyakran találkozunk vele - legtöbb sejt életciklusa bizonyos fázisában igyekszik helyhez kötődni • Élő sejtek polimer gélbe zárását először 1969 -ben Updike és mtsai írták le • Tudományos és ipari jelentőség: pl. aminosavak, szerves savak, antibiotikumok, szteroidok, enzimek előállítása • Környezeti alkalmazásuk is egyre jobban terjed

Előnyök • Védjük a rögzített sejteket a külső behatásoktól, valamint megakadályozzuk eltávozásukat a reakciótérből • Állati és növényi sejteket, szöveteket is lehet immobilizálni • Számos biokatalitikus rendszer számára előnyös • Javul a metabolikus aktivitása a sejteknek • Plazmid stabilitás nő • Kisebb a fertőzés veszélye • könnyebben tárolható Hátrányok • A szaporodó sejtek kiszabadulhatnak az immobilizáló anyagból, ha szétfeszítik azt • A diffúziós barrier a mátrix, vagy a nagy sejtsűrűség miatt növekedhet • Aerob rdsz-knél az oxigénhez gátolt lehet a hozzáférés

Milyen paramétereknek kell megfelelnie egy jó hordozónak: • Nem-toxikus • Nem szennyező • Jó minőségű, hosszú élettartam • Biztosított legyen a sejtaktivitás és denzitás • Biztosított legyen a sejtek kijutása a célhelyre (ha szükséges) Hordozók • Természetes agar, agaróz, alginát, karragenan, cellulóz, kollagén, stb és szintetikus polimerek: poliakrilamid polisztirén poliuretán • • Egyéb: üveg, kerámia, agyag, apatit, alginit, ioncserélő gyanták

Immobilizálási stratégiák 1. felületi adszorpció 2. bezárás a: encapsulation b: entrapment 2. a, 3. keresztkötés 4. biofilm képzés 3. 5. aggregátum képzés, flokkuláció 6. hordozóhoz kötés (ionos, kovalens) 4. , 5. 6. b,

A sejtek a szilárd felszínhez egy/több fehérjén keresztül kapcsolódnak Lpp = lipoprotein Omp. A = outer membrane protein A Am. Cyan = cyan-fluorescent protein

Alginát • Barna algából nyerik • Lineáris poliszaharid, b-D-mannuronát (M) és a-L-guluronát (G), 1 4 kötések • Homopolimer blokkok (G-, M-blokk) ill és vegyes blokkok (GM blokk) random szerveződnek (az alginát eredetétől függően egyedi szerkezet/felépítés) • G-blokk divalens kationokkal (Ca 2+, Ba 2+, stb) stabil keresztkötéseket hoz létre, ennek köszönhető, hogy immobilizáláshoz használni tudjuk • Több G-blokk esetén erősebb, rigidebb gélt kapunk és kisebb porusméreteket, több Mblokk esetén lágyabb a gél és nagyobb porusméreteket találunk • A gélesedés nem hőmérséklet függő M frakciót jelképezi Keresztkötött G frakciót jelöli Gélesedési zóna

Alginát gélágy kialakítása Egyszerű, sejt- és környezetbarát módszer sejtszuszpenzió Alginát oldat Metabolitok, anyagcsere termékek sejtek Alginát burok tápanyagok Idegen mikróbák Ca. Cl 2 oldat

karrageenan • Vörös algák termelik • 3 típus: i-, l-, k-karrageenan • Nagyon sokféle forma, de az alapváz közös: b(1, 3)-D-galaktóz és a(1, 4)-D-galaktóz molekulák váltják egymást, viszont eltérnek abban, hogy a két cukor hol szulfonált és mennyi szulfoncsoportot tartalmaz • A gélesedés hőmérséklet függő folyamat, K+ ionok jelenlétében • Hátránya, hogy a gélesedéshez legalább 40°C szükséges, mely az immobilizálandó mikrobák többségének kedvezőtlen melegítés hűtés

Gelrite • Természetes anionos poliszaharid, glükuronsav, rhamnóz és glükóz alegységekből épül fel • rigid, agarszerű gélt képez elsősorban kétértékű kationok jelenlétében • hőstabil

Kitozán • Kationos polimer, D-glükózamin egységekből épül fel • Legtöbb savban, főleg szerves savakban oldható • Nem toxikus, lebontható • Kozmetikai, orvosi, élelmiszeripari jelentősége is van

ciklodextrin • A ciklodextrin keményítőből előállítható, belül üreges, henger alakú molekula, amelybe, mint egy kapszulába, bezárhatók más anyagok molekulái. • A keményítőben a kötéseket a térállású OHcsoportok hozzák létre, minden kötés ugyanolyan irányba fordul, ezért a keményítő molekulája úgy csavarodik, mint egy spirálrugó, vagyis hélixszerkezetű. • A Bacillus macerans (és néhány egyéb mikroorganizmus) által termelt enzim ezt a hélix szerkezetet úgy hasítja el egyszerre két helyen, hogy egyúttal össze is zárja a keletkező két szabad végcsoportot, s így alakul ki a ciklodextrin-szerkezet. • E molekuláris „csomagolóanyag” lehetővé teszi, hogy új, a meglevőknél hatékonyabb gyógyszereket gyártsunk. • környezeti alkalmazhatósága is bizonyított, mivel immobilizálja a szennyeződéseket, vagy akár a remediációhoz használandó mikrobákat alfa-ciklodextrin (a hidrogénatomokat zöld, az oxigént piros, a szenet szürke színű gömbök jelölik)

Poliakrilamid • Az akrilamid gyökképző (ammónium perszulfát) hatására lineáris polimert képez, s ezt a polimerizációs folyamatot katalizátorral (TEMED) lehet gyorsítani. A térhálós polimer szerkezet kialakítása bis-akrilamid alkalmazásával oldható meg. Ilyen térhálós szerkezet nemcsak makromolekulák, fehérjék, nukleinsavak elválasztását, de immobilizálását is lehetővé teszi. kaolin agyag polyacrylamide ‘híddal’ metastabil szerkezetet hoz létre (SEM image)

Polisztirol • Polisztirollal mindenhol találkozunk környezetünkben • A polisztirol a sztirol polimerizációs terméke, policiklusos aromás szénhidrogén. • a sztirol a kőolaj feldolgozás egyik mellékterméke, normál hőmérsékleten meglehetősen állandó (az Egészségügyi Világszervezet (WHO) szabványa szerint azonban mérgező, és rákkeltőként is figyelembe kell venni). Könnyen polimerizálódik • A polisztirol ellenáll a savaknak, lúgoknak, de a legtöbb szerves oldószer megtámadja, és érzékeny a fényre is. • Az 1930 -as évektől használják intenzíven, először szintetikus gumit állítottak elő belőle

Poliuretán A B • A poliuretán (PUR) csaknem korlátlan lehetőségekkel bíró termoplasztikus műanyag. Régóta alkotóeleme mindennapi életünknek. Két, speciális receptúra szerint előállított komponensből (A - poliol, B - izocianát) áll, melyből az adalékok mennyisége és minősége, valamint a komponensek keverési aránya alapján kemény, félkemény és lágy habanyagok, öntőmasszák, lágy vagy kemény elasztomerek gyárthatók a legkülönbözőbb felhasználási célokra.

Bioremediációs alkalmazások • Fontos szempontok: produktivitás stabilitás az alkalmazás során stabilitás a tárolás során érzékenység a szennyezőanyagokra egyszerű/összetett biztonság előnyök/hátrányok • Szennyvíz tisztítás, talaj remediáció, biofilm, bioreaktorok,

Biodegradáció immobilizált sejtekkel és enzimekkel példák 1. Szerves-foszfát peszticidek bontása: Pseudomonas diminuta - foszfotriészteráz enzim széles szubsztrát specifitás paraoxon hidrolizis: immobilizálás: (porózus szilikagélre), tritil agaróz egyszerű eljárás fix-ágyas csőreaktor pumpa bioreaktor UV/VIS szubsztrát detektor gyűjtőtartály

2. Herbicidek bontására példa: glifozát széles spektrumú herbicid, előszeretettel alkalmazzák (Monsanto szennyvízkezelés szükségessé vált) pilot plant: kovaföldre immobilizált mikroba konzorcium Szennyvíz tározótó Tápanyag tank H 2 SO 4 levegő Kiegyenlítő tank b i o r e a k t o r

3. Fenolos hulladékok bontása Fusarium flocciferum poliuretán + felületaktív anyag 1 g/L fenol koncentráció mellett négy hónap alatt teljesen elbontja 4. Pentaklórfenol bontása Arthrobacter sp. koimmobilizált rendszer: a baktériumot aktív szénre rögzíti, majd alginát oldatba adagolja (egyéb hordozókat is vizsgáltak) levegő elhasznált levegő gélmembrán A kapszula belsejében Az adszorbens és a sejtek CO 2 csapda Fontos paraméterek: az adszorbens mennyisége, az alginát gél porozitása, segíti a PCP adszorbciót és mineralizációt felületaktív anyag jelenléte

PCP bontása Arthrobacter-rel

Alginát gélbe zárt, CP bontásban élenjáró baktériumok összehasonlítása baktériumok: Pseudomonas putida, Pseudomonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter 3 4 6 2 1 3 1. 2. 3. 4. 10 mg/L CP – free c. 50 mg/L CP – free c. 10 mg/L CP – imm. c. 50 mg/L CP – imm. c. 1 2 4 4 1. 2. 3. 4. 5. 6. 3 5 5 mg/L CP – free c. 10 mg/L CP – free c. 5 mg/L CP – imm. c. 10 mg/L CP – imm. c. 50 mg/L CP – imm. c. 1. 2. 3. 4. 5 mg/L CP – free c. 50 mg/L CP – free c. 5 mg/L CP – imm. c. 50 mg/L CP – imm. c.

5. Fenol bontás kevert kultúrával üveglapra kolloid szilika oldatba kevert mikroorganizmusok rögzítése, a rögzült rétegre újabb szilika réteget visznek.

6. p-nitrofenol (PNP) bontása peszticid és gyógyszergyártásban fordul elő Pseudomonas sp. 8 törzs együttesen (P. putida, P. fluorescens, P. mendonica) Kovaföld hordozó, oszlop bioreaktor, levegőztetett a rögzített sejtek képesek tolerálni az 1800 mg/L PNP konc. is! 7. Poliklórozott bifenilek bontása két Pseudomonas faj és egy Alcaligenes faj ko-kultúrában bont kevert PCB-t, három féle hordozón

8. Morfolin bontás Mycobacterium aurum-mal (G+ baktérium) morfolin = 1, 4 – tetrahidro – oxazin (heterociklusos vegyület: C 4 H 9 NO) származékai: adalékanyagok, oldószerek, antioxidáns anyagok, stb. gyártásuk során az effluensben morfolin jelenik meg, ezért fontos lebontásának kidolgozása

9. Nikkel - ötvözet szálakon létrehozott Thiobacillus ferrooxidans biofilm vas-szulfát oxidációja - acidofil, aerob kemolitotróf baktérium - extrém alacsony p. H (< 2, 0) a vas(III)szulfát kicsapódásának elkerülése érdekében - a baktérium igyekszik hozzátapadni szilárd felszínhez, így nem könnyen mosódik ki

10. Higany biotranszformáció fluid-ágyas bioreaktorban - különösen a szerves higany vegyületek veszélyesek, bár ipari és mezőgazdasági felhasználása ma már korlátozott, de tartósan ott maradt a környezetben, - ivóvízben < 1μg/L a max. megengedett konc. - mikrobiálisan az oxidációs állapot változtatható, illetve a szerves higany vegyületek átalakíthatók (az elemi higany kevésbé toxikus) - pl. Aeromonas hydrophilia – kofaktor függő higany reduktáz rendszere - szilika és aluminium porózus hordozóra rögzítve, de több probléma is volt, pl. az elemi higany akkumulálódott, nem távozott el. Levegőztetéssel némileg javult, és a gőztérből kihajtották a Hg-t, melyet kondenzáltak, majd reciklizálták - a problémák kiküszöbölésére új rendszer - Pseudomonas putida KT 2442, random mutagenezissel létrehoztak egy Hg(II) redukáló törzset (első próba polivinil alkohol hidrogélbe) - alginát gélbe ágyazott sejtekkel igen jó eredmények folyamatos rendszerben

11. Kadmium eltávolítása bioszorbens segítségével - abból indultak ki, hogy a poliszaharidok kötődnek fémekhez ezt a tulajdonságot fordították meg, kadmiumot a cukor polimerhez alginát, mint szorbens megfelelő volt air-lift reaktorban kivitelezve - a telítődött szorbensből megfelelő eljárással kivonható a kadmium

Flow rate: 2 dm 3/min Flow rate: 4 dm 3/min Kevesebb belépő kadmium esetén a szorpció hatékonyabb Emelt szorbens koncentráció mellett szintén kevesebb az effluens kadmium tartalma A szorbens porozitása szintén befolyásolja a kötődés hatékonyságát

12. Felületaktív anyag bontása alginát/pektát gélbe immobilizilált Comamonas terrigena baktériummal - vegyipar, gyógyszeripar, élelmiszeripar használja - negatívan hat a mikrobiális életre, mivel megbontja a membrán stabilitását, habzik befolyásolva az oxigén diffúziót (bizonyos esetekben előnyös a jelenlétük olajbontás) - gélágyba immobilizálva a sejteket megvédjük a káros hatásoktól konkrét példa: anion aktív anyag – dihexilszulfoszukcinát (DHSS) alginát/pektát kevert gélágyban Comamonas terrigena