Il dottorato in trapianti di organi e tessuti

Il dottorato in “trapianti di organi e tessuti e terapie cellulari”a Bari S. V. Impedovo, Dipartimento d’emergenza e dei trapianti di organi Urologia, Andrologia e Trapianto di rene Università degli Studi “Aldo Moro” di Bari

DOTTORATO DI RICERCA XXIX ciclo – Anno Accademico 2013/2014 presso l’Università degli Studi di Bari Aldo Moro

Il danno da ischemia/riperfusione (IRI) rappresenta il primo insulto a carico di un organo trapiantato Nel trapianto di rene da donatore cadavere, il danno da ischemia riperfusione potrebbe condurre ad una ritardata ripresa funzionale (DGF), ed ad un maggior rischio di rigetto acuto per aumento di immunogenicità dei tessuti

Obiettivo dello studio: valutare i fattori responsabili del danno da ischemia riperfusione e l’impatto della DGF sull’outcome del graft Materiali e Metodi: analisi retrospettiva di 761 pazienti sottoposti a trapianto di rene da donatore cadavere dal febbraio 1998 a luglio 2011. La DGF, definita come la necessità di trattamento dialitico nella prima settimana dopo il trapianto, è stata osservata in 241 soggetti (31. 6%).

Risultati Donors Mean Age (years) Cerebrovascular Death (%) Mean estimated creatinine clearance by MDRD formula (m. L/min) Mean serum creatinine (mg/d. L) Mean Remuzzi-Karpinsky score Extended criteria donor (%) Mean Cold Ischemia Time (hours) Recipients Mean Age (years) Mean time of dialysis before transplant (months) Hospital stay (days) IGF 43. 3 ± 18. 1 (4 - 83) 45. 8% 84. 4 m. L/min ± 32. 1 (16 240) DGF 54. 6 ± 16. 2 (12 -82) 65. 9% 75. 2 m. L/min ± 28. 7 (10 -188) P <0. 001 0. 009 1. 0 mg/d. L ± 0. 34 (0. 4 - 2. 7) 1. 6 (0 -6) 33. 5% 14. 4 ± 4. 6 (6 -33) 1. 2 mg/d. L ± 0. 62 (0. 5 -4. 5) 2. 5 (0 -6) 63. 5% 17. 4 ± 6. 7 (7 - 34) 0. 002 520 45. 0 ± 11 (10 -65) 70. 6 ± 49. 0 (2. 2 -275) 241 49. 1 ± 10. 2 (13 -65) 96. 0 ± 55. 6 (9. 8 -339. 6) <0. 001 11. 1 (5 -40) 25. 4 (6 -82) <0. 001 L’analisi multivariata, mostra che il tempo di ischemia fredda, il donatore marginale, lo score istologico e i mesi di dialisi prima del trapianto sono le uniche variabili indipendenti nell’insorgenza di DGF e quindi implicate nel danno da ischemia riperfusione <0. 001

Funzionalità renale, sopravvivenza d’organo e dei pazienti P<0. 001 Trend della creatinina P<0. 001 Sopravvivenza d’organo P<0. 001 Sopravvivenza dei pazienti

Impatto della delayed graft function • Fattore di rischio indipendente di rigetto acuto e CAD • Influenza la graft survival Perico N. et al 2004 Lancet Peeters P et al 2008 Transplantation Yates PJ et al 2006 Transpl. Immunol • Fattore di rischio di morbidità e mortalità cardiovascolare anche dopo anni Tapiawala S. N. et al 2010 J. Am. Soc. Nephrol dal trapianto renale Aumento della degenza e dei costi (a breve e lungo termine) Non esiste una terapia per prevenire la dgf o ridurre la sua durata

DGF: What’s new? Istologicamente la dgf consiste in un danno transitorio a carico delle cellule tubulari renali correlata con l’attivazione dei leucociti Questi fenomeni transitori non spiegherebbero i risultati clinici a lungo termine Oggi infatti si ritiene che la dgf e il danno tubulo interstiziale siano innescate da una vasculopatia del graft L’attivazione dell’endotelio durante il danno da ischemia riperfusione determinerebbe uno stato pro coagulante e l’espressione di molecole di adesione L’endotelio attivato produrrebbe citokine (IL 1, TNFalfa) chemiokine (Il 8, MCP)e fattori di crescita (PDGF, TGF beta) in grado di determinare oltre a fenomeni transitori, anche vasocostrizione con ipossia cronica e sviluppo di fibrosi tubulo interstiziale Perico N. et al 2004 Lancet Tepperman E et al 2010 Can. J. Surg. Yates PJ et al 2006 Transpl. Immunol Nell’ultimo decennio un maggior numero di studi ha evidenziato come il sistema del Complemento possa giocare un ruolo chiave nel danno da I/R

Il sistema del complemento Circa 30 proteine plasmatiche e di membrana che svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria come nell’infiammazione

Il sistema del complemento

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Ruolo del complemento nel danno da ischemia-riperfusione dopo trapianto renale Studies in animal I/R models, including intestinal, hindlimb, kidney, and myocardial I/R models, have established a key role of the complement system in mediation of I/R injury using complement inhibitors and knock-out animal models. As complement activation has been shown to be an early event in I/R injury, inhibiting its activation or its components may offer tissue protection after reperfusion However, clinical study results using specific complement inhibitors have largely been disappointing Diepenhorst GM et al 2009 Most of the experimental findings have been obtained in murine models and unconfirmed in the human setting

Ruolo del complemento nel danno da I/R: quale modello adottare • Alcuni studi hanno evidenziato come l’attivazione del Complemento possa differire in modo significativo tra roditori e maiali • Inoltre sembra che l’attivazione del complemento non avvenga solo a livello delle cellule tubulari, ma anche a livello delle cellule endoteliali Castellano G et al 2010 Am J. Pathol • L’attivazione del complemento è molto simile tra i pazienti trapiantati con dgf e i maiali (via classica e lectinica) ≠ Attivazione del Complemento Via Alternativa Via Classica e Lectinica Sede peritubulare Sede endoteliale

Inibire l’attivazione del complemento per prevenire il danno da I/R C 1 -INH: proteina plasmatica in grado di inibire l’attività di proteasi seriniche come C 1 r, C 1 s e MASP 2. Forma di derivazione plasmatica Forma umana ricombinante • Difficile reperibilità, più costoso • Facile reperibilità, più economico • Minore affinità per le cellule endoteliali • Maggiore endoteliali affinità per cellule • Potente inibitore in vitro e in vivo della via di attivazione del complemento classica e Lectinica (Pharming BV, Leiden) utilizzo in trials clinici per il trattamento dei pz affetti da angioedema ereditario

Ruolo del complemento nel danno da ischemia-riperfusione: metodologia Approvazione del comitato etico scientifico per sperimentazione animale Sedazione iniziale mediante iniezione im di Telazol (Tiletamina-Zolazepam 4 mg/kg) Posizionamento di catetere venoso in vena auricolare. Anestesia generale mediante infusione ev iniziale di Fentanyl (4 ug/Kg) e intubazione oro-tracheale con insufflazione di isoflurano e ossigeno + costante introduzione di fentanyl Ventilazione meccanica. Incannulamento della vena giugulare e l’arteria carotide esterna per ottenere monitoraggio dinamico della PVC e Pa.

Ruolo del complemento nel danno da ischemia-riperfusione: metodologia 1. Accesso anteriore. Isolamento del rene sinistro 2. I vasi renali e l’uretere di sinistra vengono clampati in modo da ottenere 30 minuti di ischemia calda. 3. Si procede quindi alla sezione dei vasi e l’organo viene perfuso con una soluzione fredda di Ringer lattato contenente 10. 000 UI di eparina seguiti da una soluzione di Viaspan. 4. Il rene con l’uretere ancora connesso alla vescica, viene posizionato in un recipiente con soluzione dell’Università di Wisconsin a 4°C. 5. Dopo 2 ore il rene viene riperfuso con una soluzione di Ringer e autotrapiantato sullo stesso lato con anastomosi termino terminali. 6. Il rene destro viene rimosso

Ruolo del complemento nel danno da ischemia-riperfusione: metodologia 7. Iniezione del C 1 -INH in una vena periferica, 5 minuti prima della riperfusione 8. Dopo rimozione dei clamp ed emostasi vengono eseguite le biopsie sull’organo autotrapiantato (T 15) 9. Viene posizionato un catetere sovrapubico. 10. A fine intervento vengono infusi 50 mg di tramadolo e 40 mg di furosemide 11. Dopo l’intervento vengono somministrati 500 mg di ampicillina e 50 mg di tramadolo Le prime 24 ore di degenza si svolgono in una terapia intensiva. Il maiale è sedato. Successiva assistenza in terapia semi-intensiva. Sedazione superficiale per evitare grossi movimenti e permettere l’esecuzione dei prelievi ematici ed urinari Dopo 7 gg, si procede ad eutanasia ed i reni trapiantati vengono prelevati per analisi

Ruolo del complemento nel danno da ischemia-riperfusione: analisi Funzionalità renale: esami del sangue e urine vengono eseguiti ogni 48 ore (urea e creatinina) Analisi istologica: i campioni fissati in paraffina, vengono colorati con ematossilina eosina , acido periodico di Schiff. Le lesioni tubulointerstiziali e glomerulari vengono valutate con metodica semi-qualitativa Immunofluorescenza: si preparano sezioni di 2 micrometri dai campioni di rene congelati, fissati in acetone per 10 min al fine di identificare i depositi di complemento, la localizzazione del C 1 -INH e gli infiltrati flogistici. Le sezioni vengono analizzate con il microscopio confocale Leica TCS SP 2. I componenti identificati con IF vengono quantificati mediante uno specifico software del microscopio Studio delle cellule endoteliali: si isololano cell endoteliali da diversi tessuti (rene, cuore, aorta…) al fine di estrarre RNA e proteine in vitro Isolamento dell’RNA ed analisi proteomica

Ruolo del complemento nel danno da ischemia-riperfusione: risultati Sono stati eseguiti 7 autotrapianti: Nei primi 6: scarsa diuresi e decesso precoce (prima dei 7 giorni di studio) Tecnica chirurgica: il rene sinistro viene rimosso completamente con l’uretere l’autotrapianto viene eseguito in sede controlaterale (destra). anastonosi T-T tra i vasi, ureteropieloanastomosi. Il tempo di ischemia fredda diminuito a 1 ora 7° trapianto: sopravvivenza di 7 giorni con diuresi conservata. I risultati preliminari hanno evidenziato la presenza del C 4 b e C 5 b-9 a livello peritubulare e endoteliale a livello del glomerulo