Il clonaggio di un frammento di DNA richiede

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

Sac. I 1200 bp Eco. RI

Isolamento acidi nucleici 1. lisi cellulare 2. deproteinizzazione 3. concentrazione

Purificazione acidi nucleici • Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici • Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH 4) isopropanolo

Purificazione acidi nucleici

Purificazione acidi nucleici

Isolamento DNA plasmidico • Protocollo “artigianale” • Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

Protocollo artigianale Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con Na. OH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

Analisi acidi nucleici • Spettrofotometro (quantitativa) • Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

Spettro di assorbimento del DNA 1. 5 Assorbanza (OD) 1 OD 260=50 g/ml 1. 0 OD 260/OD 280=1, 8 -2, 0 0. 5 220 240 260 280 300 320 lunghezza d’onda (nm)

Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide

PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Elettroforesi su gel di agarosio

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2006

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di ds. DNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare �Hind. III

DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente

B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore

Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) • Southern (blot) • Northern (blot) • Western (blot)

Metodi di trasferimento • Capillare • Elettroblot

Assemblaggio del blot capillare vaschetta carta 3 MM } membrana nylon gel supporto tampone

Fattori che influenzano l’ibridazione • Temperatura • Forza ionica • p. H

ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2008/2009 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

Sac. I 1200 bp Eco. RI