Il ciclo cellulare Dottrina cellulare Quando una cellula

Il ciclo cellulare Dottrina cellulare: «Quando una cellula esiste, ci dev’essere stata una cellula preesistente, proprio come un animale si origina solo da un animale e una pianta si origina solo da una pianta» 1858 Rudolf Virchow (1821 -1902)

Sommario 1. Il ciclo cellulare 2. Approcci sperimentali usati per lo studio del ciclo cellulare 3. Regolazione del ciclo cellulare 4. Mitosi 5. Meiosi

Perché è importante studiare il ciclo cellulare?

Introduzione Il ciclo cellulare, o ciclo di divisione cellulare (CDC), è la serie di eventi che avvengono in una cellula tra una divisione cellulare e quella successiva. E’ un processo geneticamente controllato, costituito da una serie di eventi coordinati e dipendenti tra loro, dai quali dipende la corretta proliferazione delle cellule. Gli eventi molecolari che controllano il ciclo cellulare sono ordinati e direzionali: ogni processo è la diretta conseguenza dell'evento precedente ed è la causa di quello successivo.

Introduzione Due eventi principali: 1. S-phase (duplicazione del materiale genetico) 2. M-phase (mitosi e citochinesi) M-phase

Introduzione

Introduzione Durata delle fasi del ciclo cellulare - G 1: variabile - S: 6 -8 ore - G 2: 2 -4 ore - M: 1 ora 2 -4 h Fase G 2 • 2° Gap • Si trova tra fase S e Mitosi • Le cellule si predispongono per la divisione mitotica –Produzione proteine specifiche (fuso mitotico, citodieresi) –Controllo del DNA replicato al fine di correggere eventuali errori • Duplicazione del centrosoma (tarda Sinizio G 2) 6 -8 h 1 h h < 12 G 0 Fase S • S = Sintesi • Durante la fase S avviene la Replicazione del DNA –Tutte le proteine che servono a tale scopo vengono sintetizzate durante la fase G 1 • Durante la fase S avviene anche la sintesi degli istoni e altre proteine della cromatina Fase G 1 • 1° Gap (Intervallo) –Tra Mitosi e la fase di replicazione del DNA (Fase S) • La fase più lunga del ciclo –Altamente variabile a seconda del tipo cellulare • Periodo di crescita cellulare (la cellula riacquista le sue dimensioni normali) –Sintesi di RNA e proteine –Preparazione per la duplicazione del DNA

Introduzione La durata del ciclo cellulare varia col variare della specie, del tipo di cellula e delle condizioni di crescita

Come si studia il ciclo cellulare Cell-Cycle Control Is Similar in All Eukaryotes Cell-Cycle Progression Can Be Studied in Various Ways Per identificare i fattori che controllano l’entrata delle cellule nelle fasi S e M del ciclo cellulare sono stati necessari esperimenti genetici e biochimici

Organismi modello per lo studio del ciclo cellulare Organismi per lo studio del ciclo cellulare • Cellule in coltura • Il lievito: Saccharomyces cerevisiae che si divide per gemmazione Schizosaccharomyces pombe che si divide per scissione • Xenopus laevis D. melanogaster Caenorhabditis elegans

Analisi genetica del ciclo cellulare S. cerevisiae Sistema sperimentale basato sull’uso di eucarioti semplici come i lieviti che sono funghi unicellulari S. pombe

Analisi genetica utilizzata per identificare mutanti temperatura-sensibili del ciclo cellulare nei lieviti Mutanti cdc Alla temperatura permissiva il prodotto dei geni cdc viene sintetizzato Alla temperatura non permissiva (o restrittiva) il gene non viene espresso

Analisi genetica utilizzata per identificare mutanti temperaturasensibili del ciclo cellulare nei lieviti

Studi genetici in C. elegans hanno chiarito i meccanismi che regolano l’ apoptosi. Sydney Brenner Robert Horwitz John Sulston • �Delle 1090 cellule somatiche generate durante lo sviluppo di C. elegans, 131 vanno incontro ad apoptosi. • Mutazioni specifiche hanno portato all’identificazione dei geni coinvolti nella regolazione dell’apoptosi

Studi biochimici su ovociti, uova ed embrioni precoci Per gli studi biochimici sul ciclo cellulare sono particolarmente adatti uova ed embrioni precoci di anfibi ed invertebrati marini. In questi organismi numerosi cicli cellulari sincroni fanno seguito alla fecondazione di uova di grandi dimensioni. Un uovo maturo di Xenopus, pronto per essere fecondato Isolando un gran numero di uova dalle femmine e facendole contemporaneamente fecondare mediante l’aggiunta di spermatozoi (o trattandole in modo da simulare la fecondazione), è possibile ottenere gli estratti necessari per l’analisi delle proteine e delle attività enzimatiche regolano il ciclo cellulare

Studio della proliferazione cellulare Visualizzazione di cellule in fase S 1_dopo somministrazione dell’analogo artificiale della timidina bromo-deossiuridina (Brd. U) mediante colorazione con anticorpi anti-Brd. U

Studio della proliferazione cellulare Visualizzazione di cellule in fase S 2_mediante autoradiografia dopo somministrazione di 3 Htimidina

Studio della proliferazione cellulare Citofluorimetria a flusso 1) Le cellule di una popolazione eterogenea vengono marcate con una o più molecole fluorescenti ed immesse in una camera di flusso dove vengono separate le une dalla altre. 2) Ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e determina l’emissione di un segnale fluorescente 3) Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un rivelatore. 4) Viene quindi processato elettronicamente, trasformato da analogico a digitale e inviato all’analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico.

Studio della proliferazione cellulare Hela cells Asynchronous Thymidine A thymidine treatment block cells at the G 1 to S-phase transition (thymidine treatment inhibits DNA synthesis) Nocodazole Cells have duplicated DNA but are blocked at mitosis (nocodazole inhibits microtubule polymerization).

THE CELL-CYCLE CONTROL SYSTEM The Cell-Cycle Control System Triggers the Major Events of the Cell Cycle

The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin. Dependent Protein Kinases (Cdks) La fosforilazione di proteine controlla la progressione attraverso il ciclo cellulare Le cicline sono state identificate sia in cellule di lievito che in cellule di mammifero. La loro concentrazione aumenta sino ad un livello massimo e poi segue una rapida degradazione. L’attività delle Cd. K è regolata dalla concentrazione delle cicline. Esistono vari tipi di cicline e vari tipi di Cdk

The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin. Dependent Protein Kinases (Cdks) Le Cdk attivate dalle cicline sono delle proteine serina-treonina chinasi. Fosforilano substrati coinvolti nelle varie fasi del ciclo, ad esempio nel passaggio tra G 1 ed S, fosforilano gli istoni e permettono la compattazione dei cromosomi. Oppure fosforilano la lamina nucleare, disassemblandola e rompendo l’involucro nucleare. Altre proteine fosforilate sono quelle del citoscheletro, che servono al macchinario della divisione.

The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin. Dependent Protein Kinases (Cdks)

The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin. Dependent Protein Kinases (Cdks)

The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin. Dependent Protein Kinases (Cdks) Le varie cicline nelle cellule di mammifero

Basi strutturali per l’attivazione delle Cdk Il sito attivo della Cdk è bloccato da una regione della proteina (ansa a T) Spostamento dell’ansa a T Aumento dell’affinità di legame ai substrati

La regolazione dell’attivtà delle Cdk da parte di fosforilazione inibitrice (2 fosforilazioni)

Inibizione del complesso ciclina-Cdk pa parte di una CKIs (Cdk Inhibitor Proteins)

Cell cycle regulators SUMMARY CAK Cyclin kinase Cyclin-Cd. K Cdk Cyclin-Cd. K CKIs (p 27) Cyclin-Cd. K P-ase

Cell cycle regulators in cancer CAK Cyclin Wee 1 Cyclin-Cd. K CKIs (p 27) Cdk Cyclin-Cd. K Alterations of genes encoding cyclindependent kinase (CDK) inhibitors p 15 (CDKN 2 B) and p 16 (CDKN 2 A) INK 4 B INK 4 A Cyclin-Cd. K Alterations of cyclin D 1 (CCND 1), CCND 2, CCND 3, CDK 4 and CDK 6 genes. Cdc 25

THE CELL-CYCLE CONTROL SYSTEM

Controllo della proteolisi da parte SCF • • CKI viene fosforilata CKI-p è riconosciuto da SCF che è costitutivamente attivo CKI-p viene poli-ubiquitinata da SCF CKI-p-poli. Ub è degradata

Controllo della proteolisi da parte APC/C

SCF e APC/C target CKI G 1, G 1/S cyclin M- cyclin

THE CELL-CYCLE CONTROL SYSTEM Arresto del ciclo cellulare Crescita cellulare Proliferazione

DNA Damage Blocks Cell Division: The DNA Damage Response

Other stimuli activating the p 53 pathway

Other stimuli activating the p 53 pathway

The p 53 signaling pathway is altered in the majority of human cancers. The TP 53 gene is deleted or mutated in approximately 55% of human cancers while its signaling is disrupted by alterations to its many regulators (listed to the right) and/or targets (not listed) in the remaining tumors.

The hallmarks of cancer

The p 53 signaling pathway is altered in the majority of human cancers.

Abnormal Proliferation Signals Cause Cell-Cycle Arrest or Apoptosis, Except in Cancer Cells

Cell Proliferation is Accompanied by Cell Growth