IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie

IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W. MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie Hôpital A. Mami de l’Ariana 25 -26 Avril 2003 www. lab 2 m. tn

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEXE • Mycobacterium tuberculosis: réservoir homme • Mycobacterium bovis: réservoir bovin • Mycobacterium africanum: Afrique noir MYCOBACTERIES NON TUBERCULEUSES ATYPIQUES • Présentes dans l’environnement sans danger pour l’homme • Responsable d’infections opportunistes chez les ID • Pays développés: recrudescence de la tuberculose (SIDA) • Nécessité d’identification des mycobactéries www. lab 2 m. tn MYCOBACTERIUM LEPRAE

CLASSIFICATION DE RUNYON • GROUPE O : Les bacilles tuberculeux • GROUPE I : Mycobactéries à croissance lente, photochromogènes • GROUPE II : Mycobactéries à croissance lente, scotochromogènes • GROUPE III : Mycobactéries à croissance lente, non chromogènes • GROUPE IV : Mycobactéries à croissance rapide, pigmentées ou non www. lab 2 m. tn

ASPECT MACROSCOPIQUE M. tuberculosis M. africanum M. bovis BCG Apparition des colonies 15 -20 j 60 -90 j 20 -40 j 15 -20 j Aspect des colonies Eugoniques Rugueuses Chou fleur Beige Dysgoniques Rugueuses Plates Mate Dysgoniques Lisses Hémisphériques Blanche Eugoniques Rugueuses Chou fleur Beige www. lab 2 m. tn

ASPECT MACROSCOPIQUE www. lab 2 m. tn

PRODUCTION DE PIGMENT • TECHNIQUE : Ensemencer deux tubes L et O avec une dilution 10 -5, culture à 37°. Croissance sur tube L, illuminer tube O sous une lampe à fluoréscence • RESULTATS : Mycobactéries sans pigmentation: Souche non chromogène ( gp III) Mycobactéries pigmentant sans illumination: Souche scotochromogène (gp II) Mycobactéries pigmentant à la lumière: Souche photochromogène (gp I) www. lab 2 m. tn

CULTURE DES MYCOBACTERIES www. lab 2 m. tn

ASPECT MICROSCOPIQUE • M. tuberculosis: bien colorés, petits, incurvés • M. kansasii: plus longs, aspect saucissoné, en échelle www. lab 2 m. tn

IDENTIFICATION PAR LES TESTS BIOCHIMIQUES • Indispensables • Seuls à établir un diagnostic d’espèces • Applicables sur les colonies obtenues par culture • Mycobactéries tuberculosis complexe ≠ Atypiques www. lab 2 m. tn

NIACINE TEST • Principe: Recherche de la niacine ou acide nicotinique • Technique: R 1: aniline à 4% dans alcool éthylique à 95° (fl brun à 4°) R 2 : bromure de cyanogène à 10% dans ED (fl brun à 4°) • Mode opératoire: +1 ml ED dans un tube de culture, laisser en contact 15 min, reprendre 0. 5 ml dans un tube et ajouter 0. 5 ml R 1 +0. 5 ml R 2: col jaune • Résultats: M. tuberculosis: niacine + M. africanum: production variable M. bovis: Négatif Mycobactéries non tuberculeues: Négatif • NB: Tests sur bandelettes (DIFCO) remplace cette manipulation www. lab 2 m. tn

NIACINE TEST www. lab 2 m. tn

NIACINE TEST SUR BANDELETTES www. lab 2 m. tn

REDUCTION DES NITRATES • Techniques: R 1: Sol de nitrate de Na 0. 01 M R 2 : Hcl dilué R 3 : sol de sulfaniline R 4 : sol de alpha naphtylamine • Mode opératoire: Mettre en suspension des colonies dans la solution 1, incuber 2 heures à 37°, ajouter une goutte R 2, deux gouttes R 3 et deux gouttes R 4 • Résultats: Positif, virage de la coloration au rouge (intensité de la couleur: + jusqu’à 5+) M. tuberculosis: positif M. bovis et M. africanum: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif NB: Pour confirmer une réaction négative ajouter poudre de zinc www. lab 2 m. tn

TEST DE NITRATE www. lab 2 m. tn

THERMOSENSIBILITE DE LA CATALASE • TECHNIQUE: Deux tubes contenant une suspension bactérienne dans tampon phosphate, un tube à température ambiante, l’autre à 68°c pendant 20 min. Après refroidissement ajouter 0. 5 ml de H 2 O 2 à 30% • RESULTAT: Positif, observation de bulles à la surface • La catalase est thermolabile pour les 3 espèces pathogènes, thermorésistante pour les atypiques www. lab 2 m. tn

BETA- GLUCOSIDASE • TECHNIQUE: Suspension de colonies de culture dans 0. 5 ml de sol. de para nitrophényl ß-D glucoside, 3 h à 37° • RESULTAT: positif, apparition d’une coloration jaune M. tuberculosis: positif M. bovis: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif (groupe I variable) www. lab 2 m. tn

UREASE EN MILIEU UREE-INDOLE M. tuberculosis: positif M. africanum: variable M. bovis: négatif ARYLSULFATASE Subtsrat: Disulfate de phénolphtaleine tripotassique dans ED Milieu: Dubos Réactif: Carbonate de sodium Technique: suspension de colonies de culture dans un tube contenant le substrat plus le milieu de Dubos, incuber 3 j à 37° et ajouter quelques gouttes de Na 2 CO 3 Résultat: positif, coloration rouge (comparer à un tube étalon) Mycobactéries tuberculeuses: négatif Mycobactéries atypiques du groupe IV (complexe fortiutum et chelonae): Positif www. lab 2 m. tn

UTILISATION DU MILIEU LÖWENSTEIN-JENSEN CONTENANT DIFFERENTS INHIBITEURS TECHNIQUE: Ensemencer avec 0. 1 ml de la dilution au 1/1000 de la suspension bactérienne, incuber 3 semaines à 37° • P. nitrobenzoate PNB à 500 ug/ml: Sensible pour les M. de la tuberculose: • Hydroxylamine HYD à 250 ug/ml: Sensible pour les M. de la tuberculose • Acide thiophène 2 carboxylique (TCH) à 2 ug/ml: Résultats: M. tuberculosis: Résistant M. bovis: Sensible M. non tuberculeuse: Résistant • D-cyclosérine: Résistant avec BCG • Pyrazinamide PZA à 50 et 100 ug/ml: Résistant avec bovis • Thiosemicarbazone Tb 1 à 10 ug /ml : groupe. IV www. lab 2 m. tn

IDENTIFICATION DES PRINCIPALES MYCOBACTERIES Groupe de de Runyon Mycobactérium spp Pigm T Temps N I A N I T U ré as e A R Y G L U CT 68° P N B H Y D T C H P Z A D C S T b 1 g e l M C N ac l + X - - - - + X - + + + - - - + - - X X + + X x + + + - - + + + + + + - + - + + - - + + + + + + - + X X + + - - + + + + + + + + + Ob. Lm Mycobacterium tuberculosis complexe tuberculosis bovis africanum BCG - - I Croissance lente photochromogene kansasii marinum - II Croissance lente scotochromogène szulgai gordonae xenopi flavescens III Croissance lente non chromogène IV Croissance rapide 37 >10 j + + 37 30 >10 j + + + + 37 avium malmoense gastri terrae triviale - - fortiutum peregrinum chelonae abscessus - - >10 j 40 37 28 >10 j 3 -5 j www. lab 2 m. tn