I TEKNOLOGI FERMENTASI 1 Pengertian Teknologi Fermentasi Fermentasi

I. TEKNOLOGI FERMENTASI 1. Pengertian Teknologi Fermentasi • • Fermentasi “fervere” (bhs Latin) artinya mendidihkan yaitu menggambarkan penampakan dari sari anggur yang terfermentasi. Fermentasi disimilasi anaerobik senyawa-senyawa organik yang disebabkan oleh aktivitas mikroorganisme atau ekstrak dari sel-sel tersebut. Contoh : pembentukan alkohol, as. Laktat dan atibiotik Teknologi fermentasi upaya manusia untuk mencapai kondisi optimal agar proses fermentasi dapat memperoleh hasil yang maksimal serta sesuai dengan target yang direncanakan secara kualitatif ataupun kuantitatif. Bahan utama fermentasi : – Mikroorganisme – Enzim – Medium/subtrat – Fermentor/bioreaktor

2. Proses Fermentasi Istilah – istilah dalam proses fermentasi : 1. Pertumbuhan pertambahan secara mikroindividu atau seluruh kelompok mikroorganisme yang hidup bersama sebagai satu koloni/biakan 2.

Energi yg dibebaskan digunakan untuk : • Asimilasi • Biosintesa • Mempetahankan aktivitas hidup • Keluar dalam bentuk panas Energi hanya sebagian Proses Fermentasi proses pemecahan karbohidrat dan asam amino secara anaerob dan aerob Pemecahan Karbohidrat Tahap I Polisakarida dipecah heksosa/pentosa Tahap II Gikolisis (meyerhof embden) Pemecahan heksosa as. piruvat

Tahapan Glikolisis Gambar : Skema Glikolisis (meyerhof embden) Cat tahap-tahap proses glikolisis terjadi pada katabolisme anaerobik maupun aerobik

Katabolisme Aerobik As. Piruvat Oksidasi as. Asetat dekarboksilasi Co-enzyma acetyl-Co. A siklus kreb Katabolisme anaerobik As. Piruvat streptococcus DPNH + H+ DPN asam laktat

3. Medium Fermentasi Fungsi Medium Fermentasi Sifat Fisik Medium : Medium padat Medium Cair menyediakan semua nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk memperoleh energi, pembentukan sel dan biosintesis produk-produk metabolisme. Proses fermentasi dilakukan melalui : Kultur Permukaan medium padat, semi padat dan cair Kultur terendam medium cair

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Komponen Medium Air (deionisasi, penambahan garam, pengaturan p. H) Karbon (molase, serealia, kentang) Nitrogen (senyawa anorganik : garam amonia & nitrat) (senyawa organik : as. Amino, urea, protein) Mineral (magnesium, phosphat, kalium sulfur, Calcium, Chlorin) Vitamin (Vit. C) Buffer Anti buih Contoh : Proses fermentasi Buih (masalah) protein dalam medium

Cara mengatasi : 1. Pemurnian parsial terhadap nutrien yg kompleks 2. Modifikasi p. H, suhu, aerasi & agitasi 3. Penambahan anti buih (alkohol, ester) Medium fermentasi dapat berupa : - Medium sintesis medium lab. - Medium kasar 1. Molase 2. Serealia 3. Pati 4. Glukosa/sukrosa 5. Garam 6. Urea 7. Nitrat 8. Tepung kedelai Sumber C Sumber N

Formulasi medium penting untuk : Perencanaan penelitian laboratorium Pengembangan skala pilot plan Proses industri fermentasi Sumber karbon Komponen medium haruslah memenuhi kebutuhan elemen dasar untuk pembentukan biomssa dan produk fermentasi serta dapat menyediakan energi yang cukup untuk biosintesis & pemeliharaan sel. Dasar perhitungan ===> pers. Stoichiometri pertumbuhan sel dan pembentukan produk yang dinyatakan secara kuantitatif; yaitu : + Sumber nitrogen + Kebut. lain ===> Sel + Produk + CO 2 + H 2 O

Tabel : Komposisi elemen bakteri, khamir & kapang (%berat kering) Elemen Karbon Hidrogen Nitrogen Phosfor Sulphur Kalium Natrium Calcium Magnesium Chlorida Besi Bakteri Khamir Kapang 50 -53 7 12 -15 2. 0 -3. 0 0. 2 -1. 0 -4. 5 0. 5 -1. 0 0. 01 -1. 1 0. 1 -0. 5 0. 02 -0. 2 45 -50 7 7 -11 0. 8 -2. 6 0. 01 -0. 24 1. 0 -4. 0 0. 01 -0. 1 -0. 3 0. 1 -0. 5 0. 01 -0. 5 40 -63 7 -10 0. 4 -4. 5 0. 1 -0. 5 0. 2 -2. 5 0. 02 -0. 5 0. 1 -1. 4 0. 1 -0. 5 0. 1 -0. 2

Sterilisasi medium perlu karena : 1. Medium mungkin mengandung sel vegetatif dan spora dari komponen medium 2. Air yang digunakan tidak bersih Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan sterilisasi : 1. Jumlah dan jenis mikroorganisme dalam medium 2. Morfologi mikroorganisme 3. Komposisi medium fermentasi 4. p. H 5. Ukuran partikel tersuspensi Metode sterilisasi medium 1. Sterilisasi sistem “Batch” a. Injeksi uap panas ke dalam mantel fermentor atau coil yang terdapat di bagian dalam fermentor b. Injeksi uap panas langsung ke dalam larutan amedium 2. Sterilisasi sistem kontinyu : a. “Continuous injector flash cooler” b. “Continuous plate heat exchange” Sistem kontinyu : - Penggunaan energi lebih tinggi - Kerusakan medium dapat dihindari - Suhu yang digunakan 140 o. C, waktu 30 -120 detik

4. Tahapan Proses Fermentasi 1. Media fermentasi 2. Penyiapan starter/kultur : a. Regenerasi starter/kultur dari agar miring : Kultur segar inokulasi tercapai pertumbuhan optimum b. Kultur/starter pada media cair : Tujuan untuk mengadakan adaptasi kultur/starter dengan medium yang digunakan Jumlah inokulum 10% dari volume fermentasi 3. Sterilisasi : Tujuan mematikan mikroorganisme pencemar atau yang tidak dikehendaki sehingga proses fermentasi berjalan sempurna. 4. Pemanenan/pemurnian hasil

Produk fermentasi dapat berupa : Larutan encer (konsentrasi ) yg mengandung mikroorganisme Bagian sel Komponen medium larut dan tidak larut Metabolik lainnya Mempersulit pengumpulan akhir Tahapan pengumpulan akhir (produk) adalah : 1. Sentrifusi/filtrasi 2. Fraksinasi/ekstraksi 3. Pemurnian produk dengan pengendapan fraksinasi menggunakan teknik kromatografi.

II. MIKROORGANISME DAN KULTUR FERMENTASI 1. Kriteria Mikroorganisme Industri Fermentasi Ciri-Ciri Strain Mikroorganisme Unggul : 1. Strain unggul 2. Secara genetik, strain stabil 3. Strain dapat memproduksi sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduksi lainnya 4. Strain mampu tumbuh dg cepat dan kuat saat diinokulasi 5. Strain dapat menghasilkan produk yg diinginkan dalam jangka waktu yg pendek dan tidak menghasilkan produk lain yg beracun 6. Strain mampu melindungi diri dari kontaminasi 7. Strain mampu disimpan dalam jangka waktu lama 8. Strain dapat menerima perubahan oleh bahan-bahan mutagenik lainnya. 2. Sumber Mikroorganisme Industri Fermentasi 1. Diisolasi dari alam (tanah, air, tanaman, dll) 2. Koleksi kultur Kultur siap dipakai Dikelola oleh badan penelitian fermentasi/swasta Hasilnya merupakan hasil isolasi secara terus-menerus

3. Isolasi dan Identifikasi mikroorganisme Cara-cara isolasi : 1. Isolasi pada agara cawan : Metode Gores Metode agar tuang 2. Isolasi dalam medium cair 3. Isolasi sel tunggal 4. Isolasi pada media seleksi-kultur diperkaya : Kultur campuran IDENTIFIKASI ISOLASI Isolat

Tahap – Tahap Isolasi Bakteri

Kunci Identifikasi Jenis Bakteri Menurut Shewan et al. (1970)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Identifikasi Bakteri Kultur dimurnikan Ditetapkan apakah organisme bersifat fototropik, aerobik atau anaerobik. Diamati sifat morfologinya dan ada tidaknya endospora Pengamatan gram Pengamatan motilitas Pengamatan pigmen Pengujian kebutuhan akan oksigen Jika organisme bersifat kimoheterotrof, dilakukan pengujian disimilasi glukosa/gula sederhana lainnya Diidentifikasi dengan “Bergey’s Manual” isolat dalam grup Pengujian lanjutan untuk membedakan di antara jenis Pengujian lengkap untuk membedakan di antara spesies

Identifikasi Bakteri Kapang 1. Agar cawan Metode goresan 1. Kultur dimurnikan Metode tuang Ditetapkan 2. 2. “ Slide Culture” apakah organisme bersifat fototropik, aerobik atau anaerobik. 3. Diamati sifatselembar morfologinya tidaknya 7 x 7 endospora Letakkan kertas dan filterada berukuran cm 2 di dasar cawan patri 4. Pengamatan gramml gliserol 10 % keatas kertas tersebut Tuangkan 5 -10 Letakkan batang gelas berbentuk huruf U 5. Pengamatan motilitas Di atas batang gelas dudukkan gelas obyek dan disampingnya gelas 6. Pengamatan pigmen penutup steril 7. Pengujian kebutuhan akan oksigen Secara aseptis tuangkan cairan PDA keatas gelas obyek 8. Jika organisme bersifat kimoheterotrof, dilakukan pengujian disimilasi Inokulasikan spora kapang diatas obyek gelas glukosa/gula sederhana lainnya Inkubasikan pada suhu kamar (32 o. C selama 3 -7 hari) 9. Diidentifikasi dengan “Bergey’s Manual” isolat dalam grup Amati menggunakan mikroskop 10. Pengujian lanjutan untuk membedakan di antara jenis 11. Pengujian lengkap untuk membedakan di antara spesies

Cara Identifikasi Kapang Secara mikroskopik, preparat kapang diamati morfologinya yaitu : 1. Hifa septat atau nonseptat 2. Miselium terang/keruh 3. Miselium berwarna/tidak berwarna 4. Memproduksi/tidak memproduksi spora seksual 5. Ciri-ciri kepala pembawa spora 7. Penampakan sporangiofora / konidiofora 8. Adanya struktur/spora spesifik (stolon, rhizoid atau “foot sel”)

Contoh Kunci Identifikasi Kapang Ordo Mucorales Sifat umum : - hifa nonseptat - spora aseksual adalah sporangiospora I. Mempunyai sporangiola ---------------- Thamnidium II. Tidak membentuk sporangiola A. Membentuk Rhizoid dan stolon, sporangiofora muncul pada noda ----- Rhizopus B. Tidak memiliki Rhizoid/stolon, Suspensor zigospora besar ----- Mucor

Identifikasi Khamir 1. Sifat morfologi : Reproduksi vegetatif Bentuk sel vegetatif 2. Sifat kultur : Karakteristik pertumbuhan dlm medium cair Karakteristik pertumbuhan dlm medium padat 3. Sifat fisiologi : Penggunaan senyawa karbon Penggunaan Nitrogen Pertumbuhan dlm medium tanpa vitamin Pertumbuhan dlm medium dg tekanan osmotik Pertumbuhan pada suhu Produksi asam Produksi senyawa ekstraseluler Hidrolisis urea Pemecah lemak Pembentuk pigmen Caranya : 1. “slide culture” 2. Metode Gores 3. Pewarnaan 4. Mikroskop Caranya : Medium cair + Glukosa, dll + Tabung Durham Pos - ada gas - warna berubah

4. Reproduksi seksual : Karakteristik askus dan askospora Infertilitas pada khamir Ascomycetes Contoh : Kunci Identifikasi 1. Reprod. veg. dg pembentukan septat & pembelahan --- Shizosaccharomyces 2. Reproduksi dg pertunasan ------------------ Endomycopsis 3. Membentuk Askospora bulat ----------------- Saccharomycetes

4. Pemeliharaan dan Pelestarian Kultur Tujuan : 1. Mencegah terjadinya perubahan genetik akibat seleksi dan mutasi alam 2. Mencegah kontaminasi 3. Mempertahankan viabilitas sel Cara-Cara Penyimpanan Kultur 1. Penyimpanan pada suhu rendah : a. Penyimpanan pada agar miring b. Penyimpanan spora dalam air c. . Penyimpanan dengan nitrogen cair 2. Penyimpanan dalam bentuk kering : a. Kultur tanah b. Lyophilisasi Prinsip Lyophilisasi 1. Penurunan suhu dibawah titik beku untuk menurunkan aktivitas enzim 2. Penghilangan air sel dengan cara pengeringan vakum untuk menghambat metabolisme

Cara Lyophilisasi 1. Sel-sel dalam fase stasioner (jumlah sel, 1010 -1011 sel/ml dibuat suspensi dalam medium pelindung ( susu, serum atau natrium glutamat) 2. Beberapa tetes suspensi dimasukkan ke dalam ampul bekukan vakum sampai sublimasi selesai 3. Ampul ditutup dan disimpan dalam refrigerator Pelestarian Kultur m. o berguna Untuk dikembangkan Menghasilkan antibiotik Menghasilkan asam amino LESTARIKAN

Lembaga Pengumpul Kultur Nama Lembaga Metode Kultur 1. ATCC Kering beku Nitrogen cair Mycoplasmatoles fasa L Alga dan Protozoa 2. CBS Nitrogen cair Fungi 3. CMI Nitriogen cair Fungi 4. IFO Kering vakum Bakteri 5. FERM Agar Bakteri 6. NRRL Liofilisasi Bakteri dan kapang Ket ATCC : The American Type Culture Collection (USA) CBS : Centralbureau Voor Schimmel Culturen (Belanda) CMI : Cemmeonweath Mycological Institute (Inggris) IFO : Institute for Fermentation (Jepang) FERM : Fermentation Research Institute (Jepang) NRRL : Northem Regional Research Center (USA)

5. Fermentor (Bioreaktor) Pengertian Fermentor Suatu reaktor yang digunakan untuk reaksi biologis dari suatu proses bioteknologi, baik menggunakan enzim larut, sel bebas dari mikroorganisme, tanaman maupun hewan ataupun enzim/sel imobilisasi Fungsi fermentor 1. Memberikan lingkungan tetap bagi optomasi pertumbuhan mikroorganisme dan aktivitas metabolisme dalam menghasilkan suatu produk yang diinginkan 2. Mencegah kontaminasi produksi dari lingkungan pada kultur sambil mencegah pelepasan kultur ke kultur lingkungan Syarat Bahan Fermentor - Bersifat tidak beracun (baja tahan karat) - Mampu menahan tekanan uap - Tahan terhadap korosi kimia dan elektrolit Kapasitas Fermentor - Skala laboratorium (1 -2 liter) - Skala pilot plan (100 -1000 liter) - Skala industri ( > 1000 liter)

Skema Sederhana Bioreaktor

Fungsi Komponen Fermentor 1. Pengaduk/Impeler a. Untuk mengurangi ukuran gelembung udara, memberikan ruang penyebaran oksigen yang lebih besar dan untuk menurunkan difusi b. Untuk memelihara lingkungan yang seragam diseluruh bagian fermentor Bentuk-bentuk pengaduk 2. Bafel Fermentor 4 Bafel Fungsi Bafel untuk mencegah pusaran dan memperbaiki efisiensi aerasi 3. Sistem Aerasi Tujuan Untuk menyediakan oksigen dalam jumlah yang cukup kepada mikroorganisme yang bearada pada kultur, agar kebutuhan metaboliknya terpenuhi dengan baik

Aturan Dasar Rancangan fermentor Tujuan : untuk menjaga agar proses fermentasi dapat berlangsung tanpa kontaminasi Aturan-aturan : 1. Tidak boleh ada hubungan antara bagian sistem yang steril dengan non steril 2. Kurangi hubungan berbentuk gelangan oleh gerakan atau fibrasi alat dan kenaikan suhu 3. Pergunakan las untuk seluruh konstruksi 4. Hindari ruang-ruang benbentuk leher 5. Senua bagian sistem harus steril (uap) 6. Gunakan katup-katup yang mudah dibersihkan/disterilkan 7. Tekanan dalam fermentor harus tetap pos Tipe Fermentor 1. Fermentor Batch (FB) 2. Fermentor Teraduk Kontinu (FTK) 3. Fermentor Tubular (FT) 4. Fermentor Tercair Berbutiran (FTB)

6. Penggandaan Skala Fermentasi Pengertian Penggandaan Skala Suatu proses perallihan dari suatu kegiatan produksi skala laboratorium ke skala industri Tahapan Pelaksanaan : 1. Skala Laboratorium 2. Skala Pilot Plan 3. Skala Industri

Fungsi penggandaan skala dalam pengembangan mikrobiologik : 1. Untuk menerapkan penemuan proses-proses baru kedalam skala industri 2. Untuk memperbaiki kultur mikroorganisme yang tersedia dengan mengembangkan strain-strain yang lebih baik, medium yang lebih efisien dan peralatan yang lebih sempurna Kondisi Lingkungan Optimal dalam Penggandana Skala 1. Faktor kimia : konsentrasi subtrat 2. Faktor fisik : Kemampuan pindah panas dan pencampuran Dasar-Dasar Metode Penggandaan Skala 1. Konstanta gaya gunting 2. Konstanta waktu pencampuran 3. Bilangan Reynolds 4. Faktor momentum 5. Efek Pengadukan

V. MEKANISME KETAHANAN MIKROORGANISME TERHADAP PROSES PENGOLAHAN Pendahuluan Tujuan pengolahan pangan : Memperpanjang masa simpan atau mengawetkan, membuat produk lain baik setengah jadi maupun yang siap untuk dikonsumsi meningkatkan daya cerna dan penerimaannya. Tujuan pengawetan terhadap bahan pangan : 1. Mencegah kerusakan fisik 2. Mencegah kerusakan kimia 3. Mencegah kerusakan biologis (mikrobiologi) 3 kelompok proses pengawetan anti mikrobial terhadap pangan : 1. Proses pengawetan yang bersifat membunuh mikroorganisme 2. Proses pengawetan yang bersifat menghambat/memperlambat pertumbuhan mikroorganisme 3. Proses pengawetan yang mencegah masuknya mikroorganisme kedalam bahan pangan

1. Ketahanan Mikroorganisme Terhadap Panas Pengawetan makanan suhu tinggi mempengaruhi 1. 2. M. o. Mutu Pada makanan yg diawetkan Cara-cara pengawetan dengan pemanasan : 1. Pasteurisasi Tujuan : 1. Untuk membunuh semua mikroorganisme patogen 2. Mengurangi jumlah mikroorganisme penyebab kerusakan makanan Pasteurisasi Low Temperature Long Time (LTLT) (suhu 62, 8 o. C ~ 30’) High Temperature Short Time (HTST) (Suhu 71, 7 o. C ~ 15’) Suhu pasteurisasi membunuh mikroorganisme : - Khamir - Kapang - Bakteri gram negatif - Sel vegetatif bakteri gram positif

Kelompok mikroorganisme yg tahan suhu pasteurisasi : 1. Bakteri thermodurik : - Streptococcus - Lactobacillus 2. Bakteri termofilik : - Bacillus - Clostridium 2. Sterilisasi Tujuan : untuk membunuh semua mikroorganisme yang ada dengan cara pengawetan dengan suhu tinggi (suhu 121 o. C ~ 15’) (suhu 135 -150 o. C ~ 2 -6 detik) Sterilisasi komersial : Sterilisasi untuk membunuh semua mikroorganisme pembusuk yang dapat tumbuh pada kondisi penyimpanan yang normal. Contoh : makanan kaleng Suhu & waktu sterilisasi dipengaruhi : 1. Sifat-sifat bahan pangan 2. p. H Ketahanan panas diantara spesies mikroorganisme : Suhu optimum pertumbuhan m. o. 1. 2. 3. Mikroorganisme psikrofilik Mikroorganisme mesofilik Mikroorganisme termofilik

2. Ketahanan Mikroorganisme terhadap Aktivitas Air Rendah Tujuan penurunan a : untuk menghambat pertumbuhan sel vegetatif, yaitu dengan cara pengeringan, penambahan garam atau gula. Kebutuhan a tiap mikroorganisme berbeda : - Bakteri a > 0, 90 - Khamir a > 0, 88 - Kapang a > 0, 80 Kebusukan makanan dapat dicegah dengan pengaturan a < 0, 70 Mekanisme ketahanan m. o terhadap a rendah : dapat mengimbangi Produksi senyawa-senyawa tertentu M. O. tekanan osmotik diluar (dapat meningkatkan tekanan osmotik dalam sel) menyerap air kembali m. o. berkembang biak

Contoh : 1. Bakteri asam-asam amino, K+ dan glukosa 2. Khamir alkohol polihidrat Kecepatan pertumbuhan sel pada a rendah lambat, karena sebagian energi digunakan untuk mensintesis komponen intraseluler Sel m. o. dapat mengimbangi perubahan a disekelilingnya, tetapi kemampuan sel terbatas sehingga pada a yang sangat rendah/tekanan osmotik sangat tinggi pertumbuhan sel terhenti Bakteri yang tahan garam dikelompokkan : 1. Bakteri halofilik (Halobacterium) 2. Bakteri halodurik (Pseudomonas) Khamir yang tahan gula dikelompokkan : 1. Khamir osmofilik (Saccharomyces) 2. Khamir osmodurik (Saccharomyces rouxii)

3. Ketahanan mikroorganisme terhadap keasaman tinggi dan senyawa lipofilat Pengasaman adalah satu cara pengawetan makanan Proses pengasaman 1. Penambahan asam 2. Fermentasi asam Perbedaan : Penurunan a p. H rendah Tidak menunjukkan proses adaptasi tetapi kecepatan pertumbuhannya akan segera berubah Mikroorganisme yg ditumbuhkan dalam p. H yg tidak optimal, menyebabkan : 1. Sel m. o. Umumnya bereaksi untuk mempertahankan p. H konstan di dalam sel 2. Pada waktu p. H diturunkan, proton dalm jumlah tinggi pada medium akan masuk ke dalam sitoplasma sel 3. Proton harus dihilangkan dari dalam sel untuk mencegah denaturasi komponen-komponen sel Untuk menghilangkan proton keluar sel perlu energi. Karena terjadi gradien konsentrasi (konsentrasi rendah ke tinggi)

PH energi akan mengakibatkan : Energi untuk sintesis komponen-komponen sel berkurang, sehingga : 1. Pertumbuhan sel menjadi lambat 2. Pertumbuhan sel berhenti Pengawetan makanan dengan asam Lipofilat lemah Misal : - Asam sorbat Mencegah kerusakan mikrobiologi karena : - Asam benzoat - Asam propionat Kelarutannya dalam bentuk tidak terdisosiasi didalam larutan membran sel dan aktivitasnya sebagai ionofor proton Contoh : asam sorbat dapat menghambat germinasi spora Bacillus cereus

4. Ketahanan Mikroorganisme Terhadap Suhu Rendah Pengawetan makanan dgn suhu rendah 1. 2. 3. 1. 2. Aktivitas m. o. duperlambat Aktivitas m. o. Berhenti (suhu freezer) Suhu chilling : 5 – 7 o. C Suhu refrigerator : 10 – 15 o. C Suhu freezer : < 0 o. C Aktivitas m. o diperlambat/berhenti m. o. dikatalis oleh enzim Reaksi-rekasi metabolisme didalam sel Kecepatan reaksi Suhu

Contoh : • Bakteri psikrofil Pseudomonas Acinetobacter • Kapang Penicillium Mucor • Khamir Debariomyces Torulopsis Proses pembekuan 1. Kematian 2. Kerusakan