I Obtention de lADN recombinant VECTEUR fragment dADN

I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu 1

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Transformation des bactéries 4) Étalement sur boîte (pour la sélection) 1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace (les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium) (utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide) 3) Ajout de milieu 2) Choc thermique à nutritif aux bactéries, 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les croissance 1 h à 37°C (cela permet l'expression des bactéries protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure) 2

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Sélection des bactéries transformées Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné) Colonie de bactéries transformées Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique 3

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné • Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C => Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide) • Il faut ensuite récupérer le plasmide 4

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné • Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. • L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN. 5

I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Les bactéries poussant sur le Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur milieu+antibiotique possèdent un plasmide avec le gène de résistance à l’antibiotique. Mais ce plasmide contient-il l’insert cloné ? Il peut y avoir Obtention d'un ADN Recombinant amplifié religation du vecteur sur luimême. Nécessité d’un crible pour trouver les clones 6 ) Vérification de la construction positifs ayant intégré l’ADN à cloner. 6

6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur luimême (2) => il faut distinguer ces deux populations 1 2 PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose 7

6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur luimême (2) => il faut distinguer ces deux populations (1) (2) PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose : Résultats du gel d’agarose : Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1) 8

6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur : 1 2 (ex : Msc. I) 9

6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction 1) Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis 2) Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose (1) (2) On obtient des cartes de restriction différentes : une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1) 10

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger ADN de séquence connue Choix d'une amorce ADN de séquence inconnue, à séquencer Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée) 5’-P-polynucléotide Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase P nucléotide La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose, 5’-P-polynucléotide Et de nucléotides didésoxyribose. Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée nucléotide P 11

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger • Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré : ADN à séquencer A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A 3' 5' amorce 5' Brins formés en présence de didésoxythymine (dd. T) dans le milieu réactionnel 5' 5' 5' dd. T T-A-T-C-G-dd. T T-A-T-C-G-T-A-A-T-dd. T T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-dd. T 12

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger • Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence. • Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide) 5' 5' 5' dd. T 1 T-A-dd. T 2 T-A-T-C-G-dd. T 3 T-A-T-C-G-T-A-A-dd. T 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-dd. T 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-dd. T 6 6 5 4 3 2 1 13

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger ADN à séquencer : A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A 3' 5' Lecture du brin complémentaire : T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des dd. T dd. A dd. G 3 1 dd. C 4 2 plus petits fragments vers les plus gros) 14

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du séquençage ADN à séquencer : 3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-T Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-A Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN. On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum) 15