I mille volti di Marilyn Monroe I fringuelli

I mille volti di Marilyn Monroe I fringuelli delle Galapagos (Charles Darwin) (Andy Warhol)

“Variability is the law of life, and as no two faces are the same, so no two bodies are alike, and no two individuals react alike and behave alike under the abnormal conditions which we know as disease” Sir William Osler (1849 -1919)

La variabilità fenotipica è frutto della variabilità genotipica. La variabilità genotipica è la conseguenza della continua azione di mutazioni sul DNA QUALE E' LA NATURA DELLE MUTAZIONI ?

Le mutazioni sono adattative o spontanee ? 1943 Salvador Luria and Max Delbruck : Per quale meccanismo compaiono individui con nuove caratteristiche ? 2 Ipotesi a confronto: adattativa vs spontanea Test di fluttuazione ingredienti: fago T 1 e E. coli Il fago T 1 infetta E. coli e ne provoca la lisi Un piccolo numero di batteri sfugge alla lisi = RESISTENZA Il fenotipo “RESISTENZA alla LISI” insorge spontaneamente oppure è indotto de novo dalla infezione ?

L’esperimento di Luria - Delbruck Ipotesi della mutazione adattativa: La resistenza alla lisi insorge in conseguenza del contatto con il fago La resistenza potrebbe essere il risultato dell'adattamento dell'individuo alla pressione selettiva imposta dal fago. Ogni individuo (batterio) presenta una modesta probabilità (ma costante tra tutti gli individui) di diventare resistente dopo essere stato esposto al fago T 1

L’esperimento di Luria - Delbruck Ipotesi della mutazione spontanea La resistenza alla lisi è il frutto di una mutazione spontanea Caratteristiche della mutazione spontanea: –Resistenza al fago non dipende dal contatto con il fago

L’esperimento di Luria- Delbruck (in pratica) Inoculiamo su X piastre N batteri che abbiamo fatto in precedenza replicare in una provetta per un certo tempo T 1 (uguale per tutti) e li infettiamo con una dose Y di fagi per un tempo T 2 (uguale per tutti). N e T 1 e T 2 e la dose di virus sono uguali per ogni piastra. Se è valida la ipotesi adattativa, allora il processo di adattamento dovrebbe produrre i suoi effetti con la stessa modalità in tutte le piastre, contribuendo alla fine alla promozione di un numero simile di colonie resistenti. Media and phage plates phage adaptation

Ipotesi della mutazione spontanea Single cell La resistenza (frutto di mutazione spontanea) può comparire durante uno qualsiasi degli eventi replicativi avvenuti in provetta e a seconda del numero di passaggi generazionali intercorsi tra la comparsa della mutazione e la semina (momento in cui i batteri sono infettati dal fago), vengono prodotti un numero diverso di individui mutati. ----> Frazione variabile di colonie resistenti

Single cell • Nell'esempio a sx (a) la mutazione avviene alla generazione 3. Il piastramento dei batteri avviene alla generazione 4. Le cellule resistenti sono 2/16. • Nell'esempio a dx (b) la mutazione avviene alla generazione 1. Il piastramento dei batteri avviene alla generazione 4. Le cellule resistenti sono 8/16.

Jackpot!!

Conclusioni Luria e Delbruck: La resistenza è il risultato di mutazioni spontanee.

1952

Tasso di mutazione oppure frequenza di mutazione ? Il tasso di mutazione corrisponde al numero di mutazioni sul numero di divisioni cellulari. LA FREQUENZA DI MUTAZIONE Il rapporto tra il numero di mutanti e il numero totale di individui della popolazione. E' soggetto a fluttuare in funzione di quando compare la mutazione.

Tasso di mutazione oppure frequenza di mutazione ? Quando il numero di individui (cellule) è elevato il numero di eventi replicativi è approssimativamente uguale al numero di individui nella popolazione.

Purine Pirimidine

Tipi di mutazione per sostituzione

Transizioni tautomeriche • Lo slittamento di una carica di protone di un atomo di idrogeno a un altro determina per una base un cambiamento che prende l'aspetto di un nuovo isomero (tautomero) • Per timina e guanina si ha la transizione chetoenolica • Per adenine e citosina si ha la transizione da forma amino a imino

cheto enol

amino imino

Riassunto Adenina (purina) --- transizione AI --- Guanina (purina) -- transizione CE -- Adenina Citosina (pirimidina) -- transizione AI -- Timina (pirimidina) -- transizione CE -- Citosina

Transizioni tautomeriche

Transizioni tautomeriche

Transizioni tautomeriche dopo due generazioni una molecola su 4 sarà irreversibilmente mutata

Altri processi mutazionali di tipo puntiforme • • • alchilazione deaminazione depurinazione intercalazione radiazionizzanti e UV per sostituzione con analoghi di basi

Agenti Alchilanti • Gli agenti alchilanti aggiungono un gruppo alchilico (metile CH 3 - oppure etile CH 3 -CH 2 -) sulla molecola substrato modificazione dell' appaiamento. • Alcuni agenti alchilanti provocano legami tra le due eliche del DNA oppure tra una molecola e un altra di DNA (cross-link) inducendo rotture nei cromosomi formazione di legami intra- e inter-molecolari del DNA

Da leggere le note Gli alchilanti usati nella terapia anti-neoplastica si dividono in diversi tipi di classi: - mostarde azotate (clorambucile, melfalan, clomesone, uramustina, mannomustina) - aziridine (diacarban, tio-TEPA, trenimon, diaziquone, esametilen-melammina) - fosfamidi (ciclofosfamide, ifosfamide, clofosfamide) - nitroso-uree (carmustina, lomustina, nimustina, semustina) - sulfoni (busulfano, treosulfano, mannogranolo) - non convenzionali (dibromodulcitolo, pipobroman, anaxirone, piperazinedione, procarbazina, dacarbazina)

Mustard gas (Di-(2 -chloroethyl) sulfide) = Iprite Il primo agente mutageno chimico a essere studiato Charlotte Auerbach

Da leggere le note (1) Il tioetere del cloroetano, più noto come iprite, è uno dei gas impiegati per la guerra chimica; è conosciuto anche come gas mostarda per il suo odore, ed è una sostanza assai stabile e quindi persistente nell'ambiente. L'iprite è un vescicante d'estrema potenza. L'iprite è liposolubile e penetra in profondità nello spessore della cute formando devastanti piaghe. Concentrazioni di 0, 15 mg d'iprite per litro d'aria risultano letali in circa dieci minuti; concentrazioni minori producono le già citate gravi lesioni, dolorose e di difficile guarigione. La sua azione è lenta (da quattro ad otto ore) ed insidiosa, poiché non si avverte dolore al contatto. È estremamente penetrante ed agisce sulla pelle anche infiltrandosi attraverso gli abiti, il cuoio, la gomma e diversi tessuti anche impermeabili all'acqua. In caso di esposizione a dosi molto elevate provoca danni gravissimi all'apparato respiratorio ed all'apparato ematopoietico. Sono descritte anche forme di cecità da cheratite. A dosaggio inferiore, la morte può sopraggiungere in una settimana circa, a causa di una depressione della risposta immunitaria per leucopenia, e secondariamente per le lesioni cutanee, che aprono la porta ad infezioni diffuse. Questa classe di molecole induce danni al DNA, per la loro tendenza a legarsi ad esso, e tutte le patologie derivanti come induzione di tumori e genotossicità. L'unica forma di intervento terapico è quella sintomatica in camera sterile, ma con scarsa utilità; gli scampati presenteranno per tutta la vita estese cicatrici deturpanti. L'iprite fu utilizzata per la prima volta in Belgio, nel settore di Ypres (da cui il nome), il 12 luglio 1917, durante la prima guerra mondiale, per iniziativa dell'esercito tedesco. Non è mai stata impiegata dagli altri eserciti durante lo stesso conflitto. Nel 1919 venne impiegata dall'Inghilterra contro i ribelli dell'Hadramaut e nel 1922, in grandi quantità, dalla Spagna per contrastare la ribellione del Riff spagnolo. Gli italiani lo usarono in Etiopia dal dicembre 1935 al maggio 1936 impiegando circa 85 tonnellate di iprite con bombe da aereo.

REDUCINE ABSORBENT, VESCICANTE IDEALE PER TENDINITI DEL CAVALLO Per le infiammazioni tendinee e le alterazioni croniche delle articolazioni. INDICAZIONI: l’utilizzo di vescicanti provoca il riassorbimento di sangue o siero nella parte tumefatta, in quanto viene ad instaurarsi una vasodilatazione che aumenta il numero di cellule fagocitarie e di ossigeno. Così facendo si ottiene inoltre un incremento del metabolismo delle cellule della zona interessata dall ’infiammazione e del flusso linfatico. Reducine Absorbent, grazie allo iodio in esso contenuto, esplica un effetto rubefacente che ha lo scopo di far riassorbire lo stato edematoso e il liquido circostante la lesione tendinea o articolare. L’impiego di Reducine Absorbent è consigliato nei casi di infiammazioni croniche e subacute. L’azione rubefacente potrebbe invece aggravare situazioni infiammatorie acute in quanto l’aumentato afflusso di sangue favorirebbe una iperacutizzazione del processo in corso. Ecco perchè l’utilizzo di questo preparato richiede una preventiva visita del Medico Veterinario per valutare le condizioni di impiego. Le lesioni croniche a carico delle articolazioni come formelle, spavenio ed esotosi di lieve gravità, possono trovare un rapido rimedio nell’utilizzo di Reducine Absorbent poichè il calore procurato artificialmente è in grado di ridurre le zoppie conseguenti a questo tipo di patologie, specie durante la stagione fredda. Il collaudato impiego e la praticità di utilizzo fanno di Reducine Absorbent un preparato di sicura efficacia, specificamente indicato per risolvere al meglio le problematiche legata alla funzionalità motoria del cavallo. Di fronte ad una mobilità spesso compromessa da intense sollecitazioni muscolotendinee dovute ad attività sportive, il Reducine Absorbent è in grado di restituire funzionalità ai tessuti, nel pieno rispetto dei processi fisiologici.

Da leggere le note (2) Iprite (2) Le caratteristiche principali del gas mostarda (azione per contatto, lunga persistenza ambientale) e le lesioni che procura (ad insorgenza lenta ed inabilitanti per lungo periodo) lo resero subito un'arma innovativa in una guerra che cercava nella tecnologia una soluzione per sfuggire dall'immobilità della guerra di trincea. La diffusione avveniva essenzialmente tramite proiettili d'artiglieria, di rado tramite bombe d'aereo; a causa della sua scarsa attività e della lentezza dell'idrolisi alla quale è soggetto (e che lo inattiva), il gas può persistere nel terreno parecchi giorni o settimane; per questo motivo l'iprite trovò specialmente impiego in attacco, per annullare l'azione dell'artiglieria avversaria e bloccare l'arrivo dei rinforzi sulle prime linee. Nella seconda guerra mondiale l'iprite non fu utilizzata nei campi di battaglia ma gli eserciti di entrambi gli schieramenti ne disponevano di abbondanti scorte, come elemento di dissuasione nel caso l'avversario avesse impiegato tale tipo di arma. Tuttavia nel dicembre del 1943, nel corso dell' attacco aereo dell' aviazione tedesca alle navi alleate nel porto di Bari, fu colpito e distrutto un cargo statunitense che trasportava munizioni all'iprite la cui esplosione provocò quello che fu successivamente chiamato il Disastro di Bari. In conseguenza di questo incidente, fu allestito dagli Alleati un programma di ricerca segreto sugli effetti dei gas sull'uomo. A studiare l'effetto dell'azotoiprite furono chiamati due scienziati dell' università di Yale, Louis Goodman e Alfred Gilman. Studiando gli effetti mielotossici selettivi che si erano riscontrati sui sopravvissuti agli effetti vescicanti dell'iprite a Bari, (effetti per altro già individuati nel 1919 da Edward ed Helen Krumbhaar, una coppia di patologi americani, su pochi reduci intossicati dal gas dopo il suo massiccio impiego bellico nella prima guerra mondiale e che, pubblicati su una rivista medica secondaria, passarono inosservati agli oncologi del tempo), diedero il via ad una sperimentazione controllata dapprima su modelli animali e poi su alcuni malati di neoplasie di origine linfatica. Riscontrarono remissioni significative, anche se di breve durata, ma i risultati non poterono essere pubblicati se non dopo la fine della guerra, per il vincolo di segretezza che copriva il programma militare. Fu comunque il primo tentativo di terapia antitumorale attraverso un approccio farmacologico a poter vantare un certo grado di successo, e viene per questo considerato l'atto di nascita della moderna chemioterapia.

Agente Alchilante EMS Azione sulla guanina Ethylmethane sulfonate (EMS) modifica guanina alla posizione N 6 e altera la specificità di accoppiamento a favore della timina Induce mutazioni G: C A: T a un tasso di 5 x 10 -4 to 5 x 10 -2 per gene

Agente Alchilante EMS Azione sulla timina La alchilazione produce appaiamenti errati

Agente Alchilante DMS (dimethyl sulfate)

DEPURINAZIONE Perdita di una adenina o guanina la guanina metilata (in seguito ad alchilazione) viene spesso persa per idrolisi (depurinazione) Avviene per rottura del legame glicosidico tra la base e lo zucchero Se non viene riparato, dà luogo a inserimento casuale di una base nella catena nascente di DNA Sono eventi molto frequenti. Un tipo di danno che si ritrova comunemente nel DNA antico

I coloranti a base di acridina causano mutazioni Frameshift Si presenta di dimensioni simili a una coppia di basi appaiate Si intercala all’interno del DNA tra due coppie di basi provocando una mutazione "frameshift"

Bromuro di etidio Colorante molto usato nel laboratorio di biologia molecolare per la proprietà di legarsi al DNA: diventa fluorescente con la esposizione alla luce ultravioletta segnalando la presenza della molecola

Deaminazione Acido nitroso è un potente mutageno Il sodio nitrato (Na. NO 3) è un comune additivo alimentare, molto impiegato durante la essiccazione per fumigatura della carne. Il nitrato di sodio non è di per se mutagenico ma lo diventa una volta metabolizzato. Così, nello stomaco il nitrato di sodio viene convertito in acido nitroso (HNO 2). L'acido nitroso è un mutageno che agisce mediante deaminazione del gruppo NH 2 della adenina e della citosina.

Deaminazione – Acido nitroso Deaminazione - gruppo amino di citosina e adenina sono convertiti in gruppo keto spontaneamente oppure ad opera di agenti mutageni come l' acido nitroso citosina diventa uracile -----> G-C diventa A-T adenina diventa hypoxanthina ------> A-T diventa G-C

Deaminazione – Acido nitroso • Deaminazione di citosina può essere riparata • Deaminazione di 5 -metilcitosina non può essere riparata • Oltre il 30% di sostituzioni di singole basi che sono causa di malattie genetiche avvengono in siti 5’-m. CG-3’

Idrossilazione Processo chimico che introduce un gruppo (-OH) in una molecola organica. La reazione è spesso facilitata da enzimi noti come idrossilasi. La idrossilazione è il primo step nella degradazione ossidativa dei composti organici all'aria. NH 2 OH Una idrossilazione particolare in quanto non catalizzata da una idrossilasi, è quella operata dalla idrossilamina, la quale idrossila il gruppo aminico della citosina (e della adenina). La citosina idrossilata si appaia con la adenina per cui G: C --> A: T

Analoghi delle Basi Molecole che prendono il posto delle purine o pirimidine nella sintesi del DNA 5 -Bromodeoxyuracil è un analogo della timina. Come per altri analoghi, presenta un tasso di trasformazione tautomerica più elevato, e pertanto sono attualmente impiegati nella terapia anti-blastica (es. fluorouracile)

Appaiamenti alternativi di 5 -bromouracil (forma enolica a carica negativa) 5 -Bromodeoxyuracil è un analogo della timina con un tasso di trasformazione tautomerica più elevato che favorisce la transizione di A--T a G---C

Quando il 5 -bromouracile è presente in forma enolica (arancio), induce la transizione G: C -> A: T. Quando il 5 bromouracile è presente in forma cheto (azzurro), induce la transizione A: T -> G: C. Generalmente le forme cheto sono più frequenti delle eno. Ma nel caso del 5 -BU la forma eno diventa più frequente, per cui le due forme acquistano prevalenza simile. Per questo si osservano transizioni in ambedue le direzioni A: T <-> G: C.

Analoghi delle Basi 2 -Amminopurina è un analogo della adenina e favorisce la transizione da A—T a G---C

Il danno da radiazioni Le radiazioni UV

Azione dei Raggi UV • Radiazioni a 260 nm agiscono principalmente su timina e citosina • Provocano la idrolisi della citosina a idrato di citosina che a sua volta determina errato appaiamento

Raggi UV causano Dimeri di Timina • Causa dimerizzazione di residui di timina (e citosina) adiacenti sulla stessa catena • Disturba appaiamento timina- adenina con la catena complementare • Dimerizzazione distorce il DNA e inibisce la replicazione

Il danno da radiazioni Le radiazionizzanti

CON LE RADIAZIONIZZANTI E' POSSIBILE MODIFICARE IL FENOTIPO Hermann MULLER University of Texas 1920 -1932 Il genoma è mutabile Le radiazioni sono in grado di indurre mutazioni.

Occhio al Bar ! Mediante esperimenti su Drosofila Muller studia come le mutazioni influenzano il fenotipo

L'esperimento di Muller per dimostrare che le radiazioni inducono mutazioni

L'esperimento di Muller La tecnica viene eseguita con femmine eterozigoti con un cromosoma X normale e uno alterato, il cromosoma Cl. B, costruito appositamente per questo esperimento. Il cromosoma Cl. B ha tre elementi. L'elemento C (che sta per crossover suppressor) consiste in una lunga inversione che sopprime la ricombinazione tra i due cromosomi X nelle femmine eterozigoti. L'inversione non previene la ricombinazione ma qualora avvenisse la progenie che reca i cromosomi X ricombinati abortisce durante lo sviluppo a causa delle gravi delezioni e duplicazioni che seguono alla ricombinazione all'interno di C.

L'esperimento di Muller L si riferisce a una mutazione recessiva letale presente sul cromosoma Cl. B. Femmine omozigoti e maschi emizigoti che recano la mutazione non sono compatibili con la vita. B si riferisce alla mutazione che provoca l'occhio Bar. B è parzialmente dominante: le femmine eterozigoti per Cl. B si riconoscono subito dalle altre. L e B si trovano all'interno del lungo tratto invertito. Muller irradia i maschi e li fa accoppiare con le femmine eterozigoti Cl. B. Tutte le femmine con occhio Bar che nascono dall'incrocio recano una copia del cromosoma Cl. B e la copia irradiata proveniente dal genitore maschile. Tale copia reca plausibilmente mutazioni a causa delle radiazioni.

L'esperimento di Muller Queste femmine vengono quindi incrociate con i maschi sani. Se nascono soltanto femmine allora vuol dire che il cromosoma X maschile reca mutazioni di tipo letale in conseguenza delle radiazioni. Se nascono femmine e maschi in rapporto 2 a 1 allora il cromosoma X maschile irradiato non reca mutazioni letali. Muller potè cosi dimostrare che irradiando i maschi con raggi X a dosi diverse aumentava corrispondentemente la frequenza di cromosomi X con mutazioni letali (fino a 150 volte).

Radiazioni ad alta intensità • Radiazionizzanti (come X-rays e raggi gamma) hanno molta più energia di raggi UV • Determinano rotture nei cromosomi che comportano delezioni e traslocazioni, ma anche fusioni tra cromosomi diversi tramite le estremità altamente adesive. I frammenti acentrici sono di solito perduti. Appaiono cromosomi dicentrici • Aneuploidia segmentale

"The Radium Girls", 1920 s

Roentgen = # ionizzazioni / vol (1 r = 2 x 10(9) ion pairs/cc)

Il danno radiochimico Le radiazionizzanti Effetti indiretti

Radiolysis of H 20 La esposizione alle radiazionizzanti induce la radiolisi ad alta energia di H 20 che scompone la molecola nei radicali H+ e OH- , e questi a loro volta diventano chimicamente reattivi, ricombinandosi tra loro a produrre specie radicali altamente reattive come il superossido (H 02) e il perossido (H 202). Sono questi poi a produrre il danno ossidativo a livello cellulare.

Radiolisi H 20 produce radicali liberi: H 2 O H + OH [hydroxy radical] HO + OH H 2 O 2 [hydrogen peroxide] HOOH H + HO 2 - [superoxide radical] danno ossidativo Un tipo di danno ossidativo diretto al DNA è quello che, tramite la ossidazione delle basi, ne altera l' appaiamento

Ossidazione della guanina in 8 -oxo-7 -hydro-guanine (GO) Si appaia con adenina dando luogo a transversione

Conseguenze mutazionali del danno ossidativo da radiazionizzanti

Vie alternative di danno al DNA: la reazione di Fenton Un alterato metabolismo del ferro può comportare l' accumulo tossico di ferro in organi come il fegato e il cervello. Si ritiene che tale accumulo di ferro comporti la produzione di radicali liberi che determinano stress ossidativo, danno e morte cellulare.

Vie alternative di danno al DNA: la reazione di Fenton Rottura della catena di DNA

La reazione di Fenton H. J. H Fenton scoprì nel 1894 che alcuni metalli presentano un elevato potere catalitico nel reagire con l'ossigeno generando radicali OH- altamente reattivi. Da questa scoperta la produzione di radicali reattivi a partire dal perossido di idrogeno catalizzata dal ferro ha preso il nome di reazione di Fenton.

Il test di Ames Investiga la mutagenicità di una sostanza • Salmonella typhimurium (his-) • Difetti nel meccanismo di riparo del DNA • Il test consiste nel valutare l'incremento di mutazioni in batteri (his-) sottoforma di revertanti his+ in seguito a trattamento con un campione sospetto, in confronto a batteri non trattati • anche i batteri non trattati produrranno "spontaneamente" un piccolo numero di revertanti

The Ames Test

The Ames Test

Molti fattori condizionano il potenziale mutageno di un prodotto

• Mutazioni Spontanee Alcune osservazioni – Insorgono naturalmente – Eventi associati alla replicazione del DNA • Mutazioni presenti nei gameti vengono ereditate • Mutazioni presenti in cellule somatiche NON sono trasmesse – Mutazioni recessive in cellule somatiche non sono rilevanti e solo raramente si manifestano • Nei gameti tutte le mutazioni sono in linea di principio rilevanti • Le mutazioni dominanti insorte a livello gametico si esprimeranno prima o poi nel prodotto del concepimento (prima generazione) • Le mutazioni recessive X-linked e autosomiche richiedono solitamente più di una generazione

Quale è il meccanismo maggiormente responsabile della produzione di mutazioni spontanee ? ? ?