http biotek ankara edu tr 400100710021 Bitkilerde Fonksiyonel

http: //biotek. ankara. edu. tr/ 400100710021 -Bitkilerde Fonksiyonel Genombilim Prof. Dr. Ali ERGÜL Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü

HAFTA-1 HAFTA-2 Bitki Genom Yapısı HAFTA-3 RNA İzolasyonu HAFTA-4 RNA İzolasyonu-UYGULAMA HAFTA-5 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Real Time PCR HAFTA-6 Real Time PCR-UYGULAMA HAFTA-7 Real Time PCR-UYGULAMA HAFTA-8 Bitkilerde Gen İfadesi ve Analizleri: Mikroarray-RNA dizileme HAFTA-9 HAFTA-10 Bitkilerde Ters Genetik -mi. RNA HAFTA-11 Tüm Genom Dizileme Çalışmaları HAFTA-12 Bitki Genom Projelerine Genel Bakış HAFTA-13 Bitkilerde Genom Düzenlenmesi (CRISPR/Cas 9) HAFTA-14 Moleküler Tarım

HAFTA 2: Bitki Genom Yapısı-II

Bitkilerde Kromozom Varyasyonu Bitki somatik hücrelerinde kromozom sayıları hep çift olmakla beraber kromozom sayıları hep diploid yada bazen poliploiddir. Bu durum bitkilere göre değişkenlik göstermektedir. Örneğin; Arabidopisis Thailiana’ da bu sayı 5 iken, kabakta 9, mısırda 10 ve buğdayda 21’ dir. Şeker kamışında ise bu sayı 100’den fazladır. Bitkilerde koromozom sayıları türlere göre değişkenlik göstermektedir. Kromozom sayısı genom büyüklüğü ile ilişkilidir. Genom büyüklüklerindeki bu değişkenlik özellikle çekirdekteki DNA içeriklerinin sitometrik, yada ekstrasyon metodları ile belirlenmesiyle daha da açık bi hale gelmiştir.

Bitkilerde Kromozom Varyasyonu Gerçekte kromozom yapısı bir çok bitki türünde değişkenlik göstermekle birlikte, genel olarak kromozom yapısı tek sentromerlidir yani sentromerin yerine göre kromozomun kolunun uzunluğu değişmektedir. Bazı bitkilerde ise, sentromer lokalize değil yaygın biçimdedir. Başka bir deyişle kromozomun tüm uzunluğu sentromer olarak görev yapmaktadır. Bu tür kromozomlar holosentrik kromozomlardır. Bitkilerde bilinen en düşük kromozom sayısı: Haplopappus gracilis‘ de 2 n=4, iken en yüksek kromozom sayısı Sedum suaveolens 2 n=640’dır. Genel olarak hücrelerdeki kromozom sayısı, kromozom büyüklüğünün azalması ile ilişkilidir.

Bitkilerde Kromozom Varyasyonu Mayozda pakiten evresinde gözlemlenen kromozom eşleşmesinde meydana gelen anormal eşleşmeler translokasyonlara yol açabilmektedir. Bu durum bazı bitkilerde poliploidi meydana getirirken bitki diploid gibi davranabilir.

Bitkilerde Denatürasyon ve Renatürasyon Kinetiği Özellikle kompleks genom yapısına sahip bitkilerde genomun anlaşılmasında Re-association çalışmaları büyük öneme sahiptir. Ökaryotik DNA kinetiğinin ölçümü ilk kez 1970’li yıllarda Britten ve Davidson tarafından gerçekleştirilmiştir. Yapılan kinetik çalışmalar birçok bitki genomunun tekrar dizileri ve düşük/tek kopya sekanslara sahip olduğunu göstermiştir. Çift zincirli DNA molekülü 0. 18 M Sodyum fosfat çözeltisi içerisinde 100°C’ de ısıtıldığında çift zincirli yapı yavaş birbirinden ayrılarak denatüre olurlar. Denatürasyon öncelikle A-T baz çiftleri oranının yüksek olduğu bölgelerde başlamaktadır. DNA’nın denatürasyona direnci G-C çiftlerinin sayısına bağlıdır. Sıcaklık tekrar 60°C’ ye getirilirse, tek zincirler tekrar birbiri ile eşleşir ve DNA renatürasyonu oluşmaktadır.

Bitkilerde Denatürasyon ve Renatürasyon Kinetiği Erime sıcaklığı (Tm): sıcaklık yükselmesiyle meydana gelen denatürasyonda DNA’nın çift sarmal yapısının yarısının kaybolmasına neden olan sıcaklık derecesi olarak tanımlanmaktadır. G-C çiftleri sayısı zengin olan DNA moleküllerinin Tm değerleri AT’ce zengin olanlardan daha yüksektir. Cot Değeri Analizleri: DNA renatürasyona dayalı olan bu biyokimyasal teknik ile DNA örneği içerisindeki tekrarlayan DNA miktarı belirlenebilmektedir. Genom yapısı ve organizasyonu bilinmek istenen örneklerde kullanılır. Temeli yüksek tekrar içeren DNA zincirlerinde renatürasyon hızlı olurken karmaşık yapılı diziler içeren zincirlerde eşleşme olayı çok daha yavaş gerçekleşecektir.

Bitkilerde Denatürasyon ve Renatürasyon Kinetiği Cot=DNA konsantrasyonu. (mol/L) X Renatürasyon süresi (sn) X Kullanılan tampon solüsyonu faktörü (solüsyondaki renatürasyon hızını etkileyen katyonlar)

Bitki Genomu- Kloroplast DNA • Kloroplast; plastid ailesinin bir üyesidir. Sadece bitkilerde ve bazı protistalarda bulunur. Bir bitki hücresinde 10 -100 adet kloroplast bulunmaktadır. • Tilakoid zar adı verilen 3. bir zar sistemine sahiptir. Bu zar tilakoid olarak adlandırılan yassı keselerin oluşturduğu bir ağ sistemini meydana getirir. • Bu yassı keseler 5 - 10 μm uzunluğunda mitokondriye benzer şekilde 2 zarla çevrelenmiş halde bulunmaktadır. • Bu 3. zar sistemlerinden dolayı kloroplastlar iç düzeni mitokondrilere göre daha kompleks organellerdir.

Bitki Genomu- Kloroplast DNA Çift iplikli, halkasal yapıdadır (120 -180 kb). Nüklear DNA gibi proteinlerle fazla ilişkili değildir. Histon içermezler. Genler içinde ve arasında intronlar bulunmaktadır. Hücre DNA’sının %10 -20’sini oluşturur. G-C içeri nukleus DNA’sına göre azdır. Kloroplast DNA’sı mitokondriyal DNA’dan daha büyüktür. Büyük kopya bölgeleri (LSC) Küçük kopya bölgeleri (SSC) 2 adet tekrar dizisi (IRA ve IRB) Plastid sentezi ile ilgili genler; r. RNAs, t. RNAs , ribosomal proteins, RNA polymerase Fotosentez ile ilgili genler; 28 thylakoid proteins, Photosystem I (psa), Photosystem II (psb), ATP synthase subunits (atp) , NADH dehydrogenase subunits (nad), Cytochrome b 6 f subunits (pet), RUBISCO large subunit (rbc. L

Bitki Genomu- Kloroplast DNA Hemen hemen tüm kara bitkilerinde Kloroplast DNA gen sayısı (yaklaşık 100) benzerdir ve bu genler hemen aynı sırada bulunmaktadırlar.

Bitki Genomu- Kloroplast DNA’ sı Nüklear DNA ile ilişki (gen değişimi) halindedir. Fotosentez enzimlerinden olan Rubisco enziminin, küçük alt birimi Nüklear DNA tarafından, büyük alt birimi ise Kloroplast DNA tarafından kodlanmaktadır. Yapılan çalışmalar kloroplast DNA’sında protein kodlayan genlerinin nüklear DNA genlerine göre yaklaşık 5 kat daha yavaş çalıştığını göstermektedir. 1980’lerde dört kara bitkisine ait (Nicotiana tabacum, Marchantia polymorpha, Oryza sativa ve Epifagus virginiana) kloroplast DNA sekanslarının tamamlanması ile diğer DNA’larla karşılaştırılması ile gen içeriklerinin daha iyi anlaşılması sağlanmıştır.

Bitki Genomu- Kloroplast DNA Günümüzde Arabidopsis thaliana, Coffea arabica, Eucalyptus globulus, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Lycopersicon esculentum, Nymphaea alba, Phaseolus vulgaris, Pinus koraiensis, Piper cenocladum, Solanum tuberosum, Triticum aestivum, Vitis vinifera, Zea mays gibi yaklaşık 114 bitkide kloroplast DNA’sı sekanslanmış durumdadır.

Bitki Genomu- Mitokondrial Dna Yapısı: İç zar, Dış Zar, Zarlar arası boşluk ve Matriks. Fonksiyonu: Solunum, ATP sentezi ve taşınması, diğer oksidasyon yolakları Halkasal yapıdadır (200 -2500 kb) Histon proteinleri içermez. Kalıtımı genelde uniparental’dir. Az korunmuştur bu nedenle yüksek düzeyde rekombinasyon göstermektedir. Mitokondriyal DNA büyüklük ve yapı bakımında Kloroplast DNA’dan daha fazla varyasyon göstermektedir

Bitki Genomu- Mitokondrial Dna Bitki mitokondriyal genomları diğer ökaryotik mitokondri genomlarına göre daha büyük ve daha kompleksdir. Bitki mitokondriyal genomları aktif rekombinasyon sistemleri ve çok parçalı genom organizasyonu içermektedir. Protein kodlama kapasiteleri hayvan ve fungal sisitemlere göre hayli düşüktür. Birçok mitokondriyal fonksiyon alt ünit kompleksleri, t. RNA, 26 S, 18 S ve 5 S r. RNAs bitkisel mitokondriyal genom tarafından kodlanmaktadır. Büyüklük ve organizasyon: Bitki mitokondri genomları bilinen aerobik organizmalara göre daha büyük ve daha kompleksdir. 200 kb dan (Brassica türlerinde) 2500 kb’a kadar(kavun) büyüklükleri değişmektedir. Memeliler, balık, amfibilerle karşılaştırıldığında bu tür canlılarda mitokondriyal genom 15 kb ile 19 kb arasında değişmektedir. Bu durum Mantarlarda ise 15 kb’dan 108’ a kadar değişiklik gösterir.

Bitki Genomu- Mitokondrial DNA Organizasyonu: Çalışmalar bitki mitokondrisinde çok parçalı genom organizasyonun varlığını açıklamaktadır. Genom organizasyonu; Ana halka ve yanında ana halkadan rekombinasyonda meydana gelen iki alt halkalardan meydana gelmektedir. Örnek olarak Brassica’da (Brassica campestris) ana halka 218 kb ve diğer alt halkalar ise 135 kb ve 85 kb’ dir.

Bitki Genomu-Mitokondriyal DNA Bitki hayvan ve mantar mitokondrilerin karşılaştırılması Bitki Hayvan Mantar Büyüklük 184 -2500 kb 14 -42 kb 17 -180 kb Kodlanmayan Çok yüksek Çok düşük Değişken Mutasyon Oranı Çok düşük Yüksek Düşük Rekombinasyon Var Yok Değişken İntron Var Yok DNA

Bitki Genomu- Mitokondriyal DNA Plastid Benzeri Moleküller: Birçok gelişmiş bitkide, linear ve halkasal DNA plasmidlerinin ve çift zincirli RNA’ların varlığı açıklanmıştır. Diger genomlarla benzerlikler; Bitki mitokondrial genomu kloroplast genomuna yüksek oranda homolog olan (>%90) geniş DNA dizileri içermektedir. Bu dizilerin kloroplast genomundaki karşılıkları kodlanan, kodlanmayan veya transkribe olmayan dizilere denk gelmektedir. Mısırda yapılan çalışmada mısır mitokondri genomunda 16 S Rrna ve 2 adet kloroplast t. RNA genleri içeren 12 kb’lık Kloroplast genomunun varlığı açıklanmıştır. Aynı şekilde nüklear DNA ve mitokondri DNA arasında da çeşitli homolog diziler açıklanmıştır. Nüklear, mitkondriyal ve kloroplast genomları arasında ise homolog dizilerin varlığı çok düşük düzeydedir. Genom büyüklüklerine göre bitki mitokondrilerinde kodlama kapasitesi oldukça düşüktür.

Ders Kapsamında Yararlanılan Kaynaklar 1. 2. 3. 4. 5. Functional Plant Genomics (Editors: J. -F. Morot-Gaudry, P. Lea, J. F. Briat) Genomics-Assisted Crop Improvement Volume 1 Genomics Approaches and Platforms (Editors: Rajeev K. Varshney, Roberto Tuberosa) Pant Functional Genomics (Editors: Erich Grotewold) Karkute, S. G. , Singh, A. K. , Gupta, O. P. , Singh, P. M. , Singh, B. 2017. "CRISPR/Cas 9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops", Frontiers in plant science, 8, 1635. Obembe, O. , Popoola, J. O. , Leelavathi, S. , & Reddy, S. V. (2011). Advances in plant molecular farming. Biotechnology advances, 29(2), 210 -222 .