HRM High Resolution Melt Analisi PostPCR per identificare

HRM (High Resolution Melt) • Analisi Post-PCR per identificare variazioni nella sequenza di acidi nucleici • Prevede una amplificazione in PCR della regione target in presenza di un ds. DNA-binding dye • Il fluoroforo emette alta fluorescenza se legato a ds. DNA • Amplificazione è seguita da uno step di high resolution melt in cui avviene la dissociazione del ds. DNA in ss. DNA • Rilascio del fluoroforo • Abbassamento della fluorescenza • Si ottiene curva di melting caratteristica del campione

HRM (High Resolution Melt) • La Tm è la temperatura in cui si la denaturazione del 50% del DNA a doppio filamento • E’ influenzato dal contenuto di GC (Tm > in prodotti di PCR ricchi di GC)

HRM (High Resolution Melt)

HRM (High Resolution Melt)

HRM (High Resolution Melt) • Workflow: 1. Calibrazione strumento (installazione software) 2. Disegno dei primer (lunghezza amplicone compresa tra 70 -130 pb, inclusi primer) 3. PCR 4. Analisi curve HRM 5. Validazione della sequenza ottenuta con Sanger (consigliato per ottimizzare il saggio) • Usato per analisi di genotyping e metilazione ma anche per barcoding

HRM (High Resolution Melt) v. Applicazioni HRM

HRM (High Resolution Melt) v. Applicazioni HRM

HRM (High Resolution Melt) v. Applicazioni HRM

HRM (High Resolution Melt)

HRM (High Resolution Melt)

HRM (High Resolution Melt)

HRM (High Resolution Melt) v. Applicazioni HRM

HRM (High Resolution Melt)