Homologous recombination HR is a multistep process that

Homologous recombination (HR) is a multistep process that is mediated by the sequential accumulation of proteins. After detection of the DNA double-strand break (DSB) and resection of the DNA in the 5'3' direction, RAD 51 binds to single-stranded (ss)DNA and displaces replication protein A (RPA), which leads to RAD 51 polymerization (this phase is referred to as the presynaptic phase). Once the homology search is successful, the duplex is captured and the RAD 51 filament invades it to form the heteroduplex structure (synaptic phase). RAD 54, a DNA-dependent ATPase, stabilizes the RAD 51– ss. DNA complex, thereby promoting this process. Heteroduplex DNA extension and branch migration normally occurs during the postsynaptic phase of HR.

DNA polymerases use the intact copy to re-synthesize the deleted DNA sequences, DNA ligases join the newly synthesized fragments and the junctions are resolved by specific endonucleases that are known as resolvases.

Intrinsico Modificazioni spontanee di basi, errori di replicazione Tipo di danno Lesioni al DNA Appaiamenti errati, inserzioni, delezioni, rotture del DNA Estensione del danno e severità Risposta cellulare Conseguenze Agenti chimici Endogeni Esogeni (radicali (mutageni liberi) chimici) Modificazioni di basi, siti abasici, rotture del DNA Addotti di DNA, crosslink, rotture del DNA Quantità e tipo di danno tollerabile Radiazioni Ultravioletti Dimeri di pirimidina, modificazioni di basi Siti abasici, modificazioni di basi, rotture del DNa Danno eccessivo e/o irriparabile Attivazione del network della risposta Sopravvivenza cellulare Ionizzanti Attivazione della pathway apoptotica Trasformazione maligna Morte cellulare

Overview sul controllo del ciclo cellulare Due punti irreversibili nel ciclo cellulare Replicazione del materiale genetico Separazione dei cromatidi fratelli Checkpoints sister chromatids centromere

La lunghezza del ciclo cellulare e la durata di ciascuna fase sono controllate da segnali chimici esterni ed interni. La transizione da ciascuna fase del ciclo richiede l’integrazione di segnali chimici specifici e risposte precise a questi segnali. Un checkpoint è da un insieme che bloccano della cellula nel a quando un cellulare sia completato. costituito di eventi l’avanzamento ciclo fino processo importante

• Tre principali checkpoints: – G 1/S • can DNA synthesis begin? – G 2/M • has DNA synthesis been completed correctly? • commitment to mitosis – spindle checkpoint • are all chromosomes attached to spindle? • can sister chromatids separate correctly?

G 1/S checkpoint • Uno dei più importanti punti di controllo del ciclo cellulare, detto START, si trova alla metà della fase G 1 • In questo punto la cellula riceve segnali interni ed esterni per stabilire quando è opportuno avanzare nella fase S: • Segnali interni: dimensione della cellula e nutrizione della cellula. • Segnali esterni : “fattori di crescita” u Se la cellula non riceve segnali, esce dal ciclo ed entra nella fase G 0

• G 0 phase – non-dividing, differentiated state – most human cells in G 0 phase § liver cells § in G 0, but can be “called back” to cell cycle by external cues § nerve & muscle cells § highly specialized § arrested in G 0 & can never divide

CDK e cicline • Due tipi di proteine hanno un ruolo importante nella progressione del ciclo cellulare: le cicline e le chinasi ciclina-dipendenti (CDK). • I complessi formati tra le cicline e le CDK inducono la progressione del ciclo cellulare. • Le CDK regolano le attività di altre proteine trasferendo loro gruppi fosfato. • Quando le cicline sono assenti , le CDK sono inattive. activated Cdk

Spindle checkpoint G 2 / M checkpoint Chromosomes attached at metaphase plate • Replication completed • DNA integrity Active Inactive Cdk / G 2 cyclin (MPF) M Active APC C cytokinesis mitosis G 2 G 1 S MPF = Mitosis Promoting Factor APC = Anaphase Promoting Complex Cdk / G 1 cyclin Active G 1 / S checkpoint Inactive • Growth factors • Nutritional state of cell • Size of cell

Lo START è regolato dalle cicline di tipo D unite alla CDK 4. Proteine inibitorie con la capacità di percepire problemi nella fase G 1 tardiva, come danni al DNA, possono frenare il complesso ciclina CDK e impedire che la cellula entri nella fase S.

Cyclin & Cyclin-dependent kinases • CDKs & cyclin drive cell from one phase to next in cell cycle proper regulation of cell cycle is so key to life that the genes for these regulatory proteins have been highly conserved through evolution u the genes are basically the same in yeast, insects, plants & animals (including humans) u

Growth factor signals growth factor nuclear pore nuclear membrane P P cell division cell surface receptor protein kinase cascade Cdk E 2 F P P Rb 2 F E cytoplasm chromosome P Rb nucleus

p 53 — master regulator gene NORMAL p 53 allows cells with repaired DNA to divide. p 53 protein DNA repair enzyme p 53 protein Step 1 Step 2 Step 3 DNA damage is caused by heat, radiation, or chemicals. Cell division stops, and p 53 triggers enzymes to repair damaged region. p 53 triggers the destruction of cells damaged beyond repair. ABNORMAL p 53 abnormal p 53 protein Step 1 Step 2 DNA damage is caused by heat, radiation, or chemicals. The p 53 protein fails to stop cell division and repair DNA. Cell divides without repair to damaged DNA. cancer cell Step 3 Damaged cells continue to divide. If other damage accumulates, the cell can turn cancerous.

Trends in Cell Biology 2002; 12: 509 -16

Human DNA damage response pathway DNA damage Replication block Common intermediate ATM or ATR Signals Rad 17/RFC Transducers Hus 1/Rad 9 Chk 1 BRCA 1 Others Cell cycle Apoptosis arrest Sensors p 53 DNA repair Effectors