HLA sustav krvnih grupa 1 Geni HLA smjeteni

HLA sustav krvnih grupa 1

• Geni HLA smješteni su na kratkom kraku 6. kromosoma • Svrstani su u tri razreda Razred I (lokus A, B i C) Razred II (lokus DR, DQ, DP) Razred III (Geni koji kontroliraju sintezu komplementa) 2

• Antigeni HLA razreda I(A, B, C) prisutni su na svim stanicama s jezgrom i trombocitima • Antigeni HLA razreda II prisutni su na antigen prezentirajućim stanicama (Langenhansove stanice, monocitimakrofagi, B limfocitima i dr. ) 3

Biološka uloga antigena HLA je: • prepoznavanje stranog antigena • razlikovanje vlastitog od stranog 4

• Serološkom metodom tipizacije dokazujemo antigene na stanici • DNA tipizacijom dokazujemo gene koji su odgovorni za sintezu ovih antigena 5

Struktura antigena razreda I α 1 NH NH 2 2 Alloantigenic sites α 2 β 2 NH 2 COOH CHO α 3 Disulfide bridge Papain cleavage Plasma membrane OH P Cytoplasm COOH 6

Struktura antigena razreda II NH 2 CHO α 1 β 1 CHO α 2 β 2 CHO Plasma membrane Cytoplasm COOH 7

HLA geni na 6. kromosomu 8

Serološko dokazivanje antigena HLA • za određivanje antigena HLA na površini limfocita koristi se test mikrolimfocitotoksičnosti 9

Izolacija limfocita Limfocite se može izolirati iz: - krvi uzete na heparin - limfnog čvora 10

Separacija limfocita vrši se na Ficolmetrizoat gradijentu KRV LIMFOCITI GRADIJENT PRIJE POSLIJE 11

Krv nanešena na gradijent i sloj separinanih limfocita nakon centrifugiranja 12

• Podesi se broj limfocita • U Terasakijeve pločice prema shemi se predhodno nakapaju specifični serumi • Pločice se čuvaju zamrznute na -200 C • Limfociti se nakapaju na Terasakijeve pločice 13

Princip testa limfocitotoksičnosti HLA antigen 1 HLA antigen 2 2 1 Antitijela na HLA antigen 1 Complement Membrana stanice se ošteti. (LIZA stanice) Mrtva stanica se oboji Nema LIZE Boja Živa stanica se ne oboji 14

Pozitivna i negativna reakcija 15

Uzimanje krvi za DNA tipizaciju • epruveta krvi s EDTA antikoagulansom • VAŽNO nikako ne s heparinom • Uzeta krv se može: -čuvati u hladnjaku -zamrznuti -transportirati poštom 16

Izoliranje DNA • Lizirati eritrocite i stanice s jezgrom (leukociti) • Razoriti membranu jezgre • Odstraniti suvišne proteinazom • Otopiti dobivenu DNA u destiliranoj vodi 17

Lančana reakcija polimerazom • Dobivena DNA mješa se s: početnicama (prajmeri) Taq polimerazom • Umnažanje specifičnih DNA fragmenata vrši se u termocycler-u 18

Umnažanje DNA 19

Umnažanje DNA 20

Elektroforeza • Umnožena DNA dokazuje se elektroforezom u gelu • U gel se inkorporira etidium bromid koji se umeće u umnoženu DNA i u ultravioletnom svjetlu svijetli 21

Očitavanje i dokumentacija • Očitavanje se vrši na UV transiluminatoru • Dokumentira se slikanjem gela • Interpretacija rezultata 22

Poznavanje ovih antigena važno je za: -transplantaciju organa i tkiva - proučavanje migracija populacija - antropološka ispitivanja - kao pomoć pri postavljanju dijagnoze nekih autoimunih bolesti - u transfuzijskom liječenju ( refrakternost na transfuzije trombocita) 23